书 书 书犐犆犛 ７１ ． ０４０ ． ４０ 犌 ０４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ３３８３４ — ２０１７ 微束分析 　 扫描电子显微术生物试样扫描电子显微镜分析方法 犕犻犮狉狅犫犲犪犿犪狀犪犾狔狊犻狊 — 犛犮犪狀狀犻狀犵犲犾犲犮狋狉狅狀犿犻犮狉狅狊犮狅狆狔 — 犛犮犪狀狀犻狀犵犲犾犲犮狋狉狅狀犿犻犮狉狅狊犮狅狆犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾狊狆犲犮犻犿犲狀狊 ２０１７  ０５  ３１ 发布 ２０１８  ０４  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书目 　　 次 前言 Ⅲ ………………………………………………………………………………………………………… 引言 Ⅳ ………………………………………………………………………………………………………… １ 　 范围 １ ……………………………………………………………………………………………………… ２ 　 规范性引用文件 １ ………………………………………………………………………………………… ３ 　 术语和定义 １ ……………………………………………………………………………………………… ４ 　 基本原理 ２ ………………………………………………………………………………………………… ５ 　 仪器设备和材料 ３ ………………………………………………………………………………………… ６ 　 试样 ４ ……………………………………………………………………………………………………… ７ 　 观察分析步骤 ５ …………………………………………………………………………………………… ８ 　 结果表述 ６ ………………………………………………………………………………………………… ９ 　 异常情况的处理 ６ ………………………………………………………………………………………… １０ 　 分析结果报告 ６ …………………………………………………………………………………………… 附录 Ａ （ 资料性附录 ） 　 常用固定液的配方 ７ ……………………………………………………………… Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３３８３４ — ２０１７ 前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由全国微束分析标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ３８ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 浙江大学 、 同济大学 、 中国人民解放军第二军医大学 、 复旦大学 。 本标准主要起草人 ： 洪健 、 陈汉民 、 戎念杭 、 祝建 、 杨勇骥 、 俞彰 。 Ⅲ 犌犅 ／ 犜 ３３８３４ — ２０１７ 引 　　 言 　　 扫描电子显微镜是观察分析固态试样表面形貌和超微结构的分析仪器 ， 要求试样干燥和表面导电 。 大多数生物试样 （ 动物 、 植物和微生物 ） 水分含量高 、 不导电 ， 进行扫描电镜观察分析时极容易在真空环境中收缩变形 ， 导致真实的形态结构被破坏 ， 且不能获得良好的结构信息 。 因此 ， 需采用化学或物理的手段对生物试样进行处理 ， 才能最大限度地保持试样的原貌 ， 供扫描电镜观察和分析 。 随着电子显微镜技术的发展 ， 在扫描电镜生物试样常规化学处理方法的基础上 ， 又发展了一些新的物理处理技术如冷冻扫描电镜技术 ， 并在实践中得到了良好应用 。 为了规范扫描电镜生物试样的制备程序 ， 正确指导生物试样的扫描电镜分析工作 ， 有必要制定生物试样扫描电镜分析方法的国家标准 。 Ⅳ 犌犅 ／ 犜 ３３８３４ — ２０１７ 微束分析 　 扫描电子显微术生物试样扫描电子显微镜分析方法 １ 　 范围 本标准规定了生物试样扫描电子显微镜分析的技术要求和规范 。 本标准适用于各种类型的扫描电子显微镜 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文 件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ２１６３６ 　 微束分析 　 电子探针显微分析 （ ＥＰＭＡ ） 　 术语 ＧＢ ／ Ｔ２３４１４ 　 微束分析 　 扫描电子显微术 　 术语 ３ 　 术语和定义 ＧＢ ／ Ｔ２３４１４ 和 ＧＢ ／ Ｔ２１６３６ 界定的术语和定义以及下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 电子枪 　 犲犾犲犮狋狉狅狀犵狌狀 电子显微镜中的电子光源 ， 由一发射体 （ 加热钨丝 、 六硼化镧 ＬａＢ ６ 灯丝 、 冷场或热场发射尖端 ） 与 电子加速系统组成 。 ３ ． ２ 电子束 　 犲犾犲犮狋狉狅狀犫犲犪犿 由电子光学系统聚焦到试样表面的一束电子 。 ３ ． ３ 　 加速电压 　 犪犮犮犲犾犲狉犪狋犻狀犵狏狅犾狋犪犵犲 为加速从电子源发射的电子而加到灯丝和阳极之间的电位差 。 ３ ． ４ 生物试样 　 犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾狊狆犲犮犻犿犲狀狊 供扫描电子显微镜分析用的具有或者曾具有生命形式的各种动物 、 植物和微生物样品 。 ３ ． ５ 二次电子 　 狊犲犮狅狀犱犪狉狔犲犾犲犮狋狉狅狀 由于入射电子轰击试样而从试样表面发射的电子 。 注 ： 通常把能量小于 ５０ｅＶ 的电子称为二次电子 。 ３ ． ６ 　 背散射电子 　 犫犪犮犽狊犮犪狋狋犲狉犲犱犲犾犲犮狋狉狅狀 通过背散射过程从试样的电子入射表面出射的电子 。 注 ： 通常把能量大于 ５０ｅＶ 的电子称为背散射电子 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３３８３４ — ２０１７ ３ ． ７ 图像分辨率 　 犻犿犪犵犲狉犲狊狅犾狌狋犻狅狀 能被清楚地分开 、 识别的两个图像特征之间的最小间距 。 ３ ． ８ 图像放大倍率 　 犻犿犪犵犲犿犪犵狀犻犳犻犮犪狋犻狅狀 扫描电镜显示的线性尺度 犔 与试样上扫描范围的相应长度 犾 之比则为图像放大倍率 ， 以 犕 表示 ， 犕 ＝ 犔 ／ 犾 。 ３ ． ９ 工作距离 　 狑狅狉犽犻狀犵犱犻狊狋犪狀犮犲 物镜极靴下表面与试样表面之间的距离 。 ３ ． １０ 像散 　 犪狊狋犻犵犿犪狋犻狊犿 一个物点发出的电子 ， 不是像理想柱状透镜聚焦成一点 ， 而是聚焦形成 ２ 条互成 ９０° 的分离聚焦线 。 注 ： 像散是由于极靴加工精度 、 极靴材料不均匀 、 透镜内线圈不对称及不完善的光阑形成的透镜不对称磁场产生 。 ３ ． １１ 荷电 　 犮犺犪狉犵犻狀犵 由于缺少足够的对地导电途径 ， 当试样受入射电子束轰击时其表面发生电荷积累的现象 。 ３ ． １２ 导电镀层 　 犮狅狀犱狌犮狋犻狏犲犮狅犪狋犻狀犵 一种覆盖到绝缘试样表面的低电阻材料 （ 如金 、 铂 、 铬 、 碳等 ） 薄镀层 ， 以提供电子束轰击时可能在表 面积累电荷的接地通道 。 注 ： 导电镀层一般厚度为 ２ｎｍ ～ ２０ｎｍ 。 ３ ． １３ 扫描电子显微镜 　 狊犮犪狀狀犻狀犵犲犾犲犮狋狉狅狀犿犻犮狉狅狊犮狅狆犲 ； 犛犈犕 通过电子束扫描试样表面产生放大图像的一种仪器 。 该仪器用细聚焦的高能电子束轰击试样表 面 ， 通过电子与试样相互作用产生二次电子 、 背散射电子等信息 ， 可对试样表面或断口形貌进行观察 。 ３ ． １４ 冷冻扫描电子显微镜 　 犮狉狔狅狊犮犪狀狀犻狀犵犲犾犲犮狋狉狅狀犿犻犮狉狅狊犮狅狆犲 ； 犆狉狔狅犛犈犕 样品台由液氮致冷的专用扫描电镜 ， 以及在扫描电镜上附加液氮致冷的冷冻样品台附件 ， 可将含 水 、 含油试样超低温快速冷冻至固体状态下进行观察 。 ４ 　 基本原理 ４ ． １ 　 扫描电镜的成像原理 由电子枪发射电子 ， 经聚光镜和物镜的逐级会聚 ， 形成具有一定能量和照明强度 、 束斑直径极细的 入射电子束 （ 电子探针 ）， 在扫描线圈的作用下 ， 电子束在试样表面作光栅状扫描 ， 通过闪烁体等检测器件接收试样中被激发出的二次电子 、 背散射电子等信号 ， 把它转变成光信号 ， 再经光电倍增管放大并转变成电信号 ， 最后由计算机进行信号数据处理 ， 在显示器上呈现试样表面形貌的电子图像 。 ４ ． ２ 　 冷冻扫描电镜的成像原理 冷冻扫描电镜的成像原理同常规扫描电镜 ， 区别在于样品台是由液氮致冷 ， 并可以调节温度 ， 控制 冰的升华 ， 观察的是经过超低温冷冻固化的试样 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３３８３４ — ２０１７ ５ 　 仪器设备和材料 ５ ． １ 　 扫描电镜 ５ ． １ ． １ 　 扫描电镜由电子光学系统 （ 电子枪 、 电磁透镜 、 光阑 、 扫描线圈 、 合轴线圈 、 消象散器 、 样品室 ）、 信 号检测处理系统 、 真空系统 、 电气系统和计算机系统等组成 。 ５ ． １ ． ２ 　 冷冻扫描电镜除了扫描电镜所有的组件外 ， 还包括冷冻样品台和外置的样品快速冷冻装置 ， 主 要有 ： 液氮泥装置 、 真空转移装置 、 准备室 、 扫描电镜样品室内的组件 、 控制板 、 电子箱和真空泵系统 、 氮 气和氩气装置 、 红外观察器等 。 ５ ． ２ 　 辅助制样设备 ５ ． ２ ． １ 　 临界点干燥仪 。 ５ ． ２ ． ２ 　 冷冻干燥仪 。 ５ ． ２ ． ３ 　 离子溅射仪 。 ５ ． ３ 　 仪器的环境条件 ５ ． ３ ． １ 　 电源电压及频率稳定 （ ２２０Ｖ±２２Ｖ ， ５０Ｈｚ±１Ｈｚ ）。 ５ ． ３ ． ２ 　 室内相对湿度小于 ６０％ 。 ５ ． ３ ． ３ 　 室温为 ２０℃±５℃ 。 ５ ． ３ ． ４ 　 场发射扫描电镜要求杂散电磁场干扰应小于 ０．１ μ Ｔ 。 ５ ． ３ ．