书 书 书犐犆犛 ０７ ． １００ ． ３０ 犆 ５３ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ４７８９ ． ２７ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．２７ — ２００３ 食品卫生微生物学检验 鲜乳中抗生素残留检验 犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犳狅狅犱犺狔犵犻犲狀犲 — 犈狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狉犲狊犻犱狌犲狅犳犪狀狋犻犫犻狅狋犻犮狊犻狀犳狉犲狊犺犿犻犾犽 ２００８  １１  ２１ 发布 ２００９  ０３  ０１ 实施 中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准修改采用了国际分析家学会 （ ＡＯＡＣ ） ＡＯＡＣ９８２．１８ 《 液体牛奶制品中的 β  乳胺抗生素定性 的颜色反应试验 》（ ＡＯＡＣＯｆｆｉｃｉａｌＭｅｔｈｏｄ９８２．１８ ： Ｂｅｔａｌａｃｔａｍａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｉｎｆｌｕｉｄｍｉｌｋｐｒｏｄｕｃｔｓ — Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｃｏｌｏｒｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｓｔｓ ） 作为第二法 。 本标准与 ＡＯＡＣ９８２．１８ 相比主要区别如下 ： ——— 扩大适用范围为鲜乳中能抑制嗜热脂肪芽胞杆菌卡利德变种 （ 犅犪犮犻犾犾狌狊狊狋犲犪狉狅狋犺犲狉犿狅狆犺犻犾狌狊 ｖａｒ． 犮犪犾犻犱狅犾犪犮狋犻狊 ） 的抗生素的检验 ， 也可用于复原乳 、 消毒灭菌乳 、 乳粉中抗生素的检测 ； ——— 修改了试剂盒加营养片方法 ， 直接将含有试验菌株芽胞的培养基制备在小试管内 ； ——— 将 “ 注 ： 偶尔有特殊批次的试剂盒可能需要较长的温育时间才能完全显色 。 如果 …… 每隔 １０ｍｉｎ 检查一次颜色显示情况 ， 并记录每个批号产品所需要的最适当的温育时间 。（ Ｎｏｔｅ ： ＯｃｃａｓｉｏｎａｌｌｙｋｉｔｓｏｆａｐａｒｔｉｃｕｌａｒＬｏｔＮｏ．ｍａｙｒｅｑｕｉｒｅａｌｏｎｇｅｒｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｔｉｍｅｆｏｒｃｏｌｏｒｔｏ ｆｕｌｌｙｄｅｖｅｌｏｐ．Ｉｆ …… Ｃｈｅｃｋｃｏｌｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｔ１０ｍｉｎｉｎｔｅｒｖａｌｓａｎｄｒｅｃｏｒｄｏｐｔｉｍｕｍｉｎｃｕ ｂａｔｉｏｎｔｉｍｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｅａｃｈＬｏｔＮｏ． ）” 程序修改为 “ 如果颜色没有变化 ， 须再于水浴中培养 ３０ｍｉｎ 作最终观察 ”； ——— 删除青霉素酶确证程序 。 本标准代替 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．２７ — ２００３ 《 食品卫生微生物学检验 　 鲜乳中抗生素残留量检验 》。 本标准与 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．２７ — ２００３ 相比主要修改如下 ： ——— 标准名称修改为 “ 食品卫生微生物学检验 　 鲜乳中抗生素残留检验 ”； ——— 增加了第二法 ， 将原标准的嗜热乳酸链球菌方法确定为第一法 ； ——— 增加了附录 Ａ “ 培养基和试剂 ”。 本标准的附录 Ａ 为规范性附录 。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口 。 本标准由中华人民共和国卫生部负责解释 。 本标准负责起草单位 ： 福建省疾病预防控制中心 。 本标准参加起草单位 ： 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所 、 中国检验检疫科学研究院 、 河南 省疾病预防控制中心 、 湖北省疾病预防控制中心 。 本标准主要起草人 ： 马群飞 、 郭云昌 、 李瑾 、 田卫 、 廖兴广 、 马弋 、 田静 。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ４７８９．２７ — １９８４ 、 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．２７ — １９９４ 、 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．２７ — ２００３ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４７８９ ． ２７ — ２００８ 食品卫生微生物学检验 鲜乳中抗生素残留检验 １ 　 范围 本标准规定了鲜乳中抗生素残留的检验方法 。 本标准的第一法适用于鲜乳中能抑制嗜热链球菌 （ 犛狋狉犲狆狋狅犮狅犮犮狌狊狋犺犲狉犿狅狆犺犻犾狌狊 ） 的抗生素的检验 ； 第二法适用于鲜乳中能抑制嗜热脂肪芽胞杆菌卡利德变种 （ 犅犪犮犻犾犾狌狊狊狋犲犪狉狅狋犺犲狉犿狅狆犺犻犾狌狊 ｖａｒ． 犮犪犾犻犱狅犾犪 犮狋犻狊 ） 的抗生素的检验 ， 也可用于复原乳 、 消毒灭菌乳 、 乳粉中抗生素的检测 。 第一法 　 嗜热链球菌抑制法 ２ 　 原理 样品经过 ８０℃ 杀菌后 ， 添加嗜热链球菌菌液 。 培养一段时间后 ， 嗜热链球菌开始增殖 。 这时候加 入代谢底物 ２ ， ３ ， ５ 氯化三苯四氮唑 （ ＴＴＣ ）， 若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限 ， 嗜 热链球菌将继续增殖 ， 还原 ＴＴＣ 成为红色物质 。 相反 ， 如果样品中含有高于检测限的抑菌剂 ， 则嗜热 链球菌受到抑制 ， 因此指示剂 ＴＴＣ 不还原 ， 保持原色 。 ３ 　 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外 ， 其他设备和材料如下 ： ３ ． １ 　 冰箱 ： ２℃ ～ ５℃ 、 －２０℃ ～ －５℃ 。 ３ ． ２ 　 恒温培养箱 ： ３６℃±１℃ 。 ３ ． ３ 　 带盖恒温水浴锅 ： ３６℃±１℃ 、 ８０℃±２℃ 。 ３ ． ４ 　 天平 ： 感量 ０．１ｇ 、 ０．００１ｇ 。 ３ ． ５ 　 无菌吸管 ： １ｍＬ （ 具 ０．０１ｍＬ 刻度 ）， １０．０ｍＬ （ 具 ０．１ｍＬ 刻度 ） 或微量移液器及吸头 。 ３ ． ６ 　 无菌试管 ： １８ｍｍ×１８０ｍｍ 。 ３ ． ７ 　 温度计 ： ０℃ ～ １００℃ 。 ３ ． ８ 　 旋涡混匀器 。 ４ 　 菌种 、 培养基和试剂 ４ ． １ 　 菌种 ： 嗜热链球菌 。 ４ ． ２ 　 灭菌脱脂乳 ： 见第 Ａ．１ 章 。 ４ ． ３ 　 ４％２ ， ３ ， ５ 氯化三苯四氮唑 （ ＴＴＣ ） 水溶液 ： 见第 Ａ．２ 章 。 ４ ． ４ 　 青霉素 Ｇ 参照溶液 ： 见第 Ａ．３ 章 。 ５ 　 检验程序 鲜乳中抗生素残留检验程序见图 １ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ４７８９ ． ２７ — ２００８ 图 １ 　 鲜乳中抗生素残留检验流程图 ６ 　 操作步骤 ６ ． １ 　 活化菌种 取一接种环嗜热链球菌菌种 ， 接种在 ９ｍＬ 灭菌脱脂乳中 ， 置 ３６℃±１℃ 恒温培养箱中培养 １２ｈ ～ １５ｈ 后 ， 置 ２℃ ～ ５℃ 冰箱保存备用 。 每 １５ｄ 转种一次 。 ６ ． ２ 　 测试菌液 将经过活化的嗜热链球菌菌种接种灭菌脱脂乳 ， ３６℃±１℃ 培养 １５ｈ±１ｈ ， 加入相同体积的灭菌 脱脂乳混匀稀释成为测试菌液 。 ６ ． ３ 　 培养 取样品 ９ｍＬ ， 置 １８ｍｍ×１８０ｍｍ 试管内 ， 每份样品另外做一份平行样 。 同时再做阴性和阳性对 ２ 犌犅 ／ 犜 ４７８９ ． ２７ — ２００８ 照各一份 ， 阳性对照管用 ９ｍＬ 青霉素 Ｇ 参照溶液 ， 阴性对照管用 ９ｍＬ 灭菌脱脂乳 。 所有试管置 ８０℃±２℃ 水浴加热 ５ｍｉｎ ， 冷却至 ３７℃ 以下 ， 加入测试菌液 １ｍＬ ， 轻轻旋转试管混匀 。 ３６℃±１℃ 水浴培养 ２ｈ ， 加 ４％ＴＴＣ 水溶液 ０．３ｍＬ ， 在旋涡混匀器上混合 １５ｓ 或振动试管混匀 。 ３６℃±１℃ 水 浴避光培养 ３０ｍｉｎ ， 观察颜色变化 。 如果颜色没有变化 ， 于水浴中继续避光培养 ３０ｍｉｎ 作最终观察 。 观察时要迅速 ， 避免光照过久出现干扰 。 ６ ． ４ 　 判断方法 在白色背景前观察 ， 试管中样品呈乳的原色时 ， 指示乳中有抗生素存在 ， 为阳性结果 。 试管中样品 呈红色为阴性结果 。 如最终观察现象仍为可疑 ， 建议重新检测 。 ７ 　 报告 最终观察时 ， 样品变为红色 ， 报告为抗生素残留阴性 。 样品依然呈乳的原色 ， 报告为抗生素残留 阳性 。 本方法检测几种常见抗生素的最低检出限为 ： 青霉素 ０．００４ＩＵ ， 链霉素 ０．５ＩＵ ， 庆大霉素 ０．４ＩＵ ， 卡那霉素 ５ＩＵ 。 第二法 　 嗜热脂肪芽胞杆菌抑制法 ８ 　 原理 培养基预先混合嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞 ， 并含有 ｐＨ 指示剂 （ 溴甲酚紫 ）。 加入样品并孵育后 ， 若该 样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限 ， 细菌芽胞将在培养基中生长并利用糖产酸 ， ｐＨ 指示 剂的紫色变为黄色 。 相反 ， 如果样品中含有高于检测限的抗生素 ， 则细菌芽胞不会生长 ， ｐＨ 指示剂的 颜色保持不变 ， 仍为紫色 。 ９ 　 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外 ， 其他设备和材料如下 ： ９ ． １ 　 冰箱 ： ２℃ ～ ５℃ 、 －２０℃ ～ －５℃ 。 ９ ． ２ 　 恒温培养箱 ： ３６℃±１℃ 、 ５６℃±１℃ 。 ９ ． ３ 　 恒温水浴锅 ： ６５℃±２℃ 、 ８０℃±２℃ 。 ９ ． ４ 　 无菌吸管或 １００ μ Ｌ 、 ２００ μ Ｌ 微量移液器及吸头 。 ９ ． ５ 　 无菌试管 ： １８ｍｍ×１８０ｍｍ 、 １５ｍｍ×１００ｍｍ 。 ９ ． ６ 　 温度计 ： ０℃ ～ １００℃ 。 ９ ． ７ 　 离心机 ： 转速 ５０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 １０ 　 菌种 、 培养基和试剂 １０ ． １ 　 菌种 ： 嗜热脂肪芽胞杆菌卡利德变种 。 １０ ． ２ 　 无菌磷酸盐缓冲液 ： 见第 Ａ．４ 章 。 １０ ． ３ 　 灭菌脱脂乳 ： 见第 Ａ．１ 章 。 １０ ． ４ 　 溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基 ： 见第 Ａ．５ 章 。 １０ ． ５ 　 青霉素 Ｇ 参照溶液 ： 见第 Ａ．３ 章 。 １１ 　 检验程序 样品中抗生素残留检验程序见图 ２ 。 ３ 犌犅