ICS07.030 A40 中华人民共和国国家标准 GB/T32262—2015 用于原子力显微镜检测的脱氧核糖核酸 样品的制备方法 Preparationofdeoxyribonucleicacidsampleforatomicforce microscopemeasurement 2015-12-10发布 2017-01-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布目 次 前言 Ⅰ ………………………………………………………………………………………………………… 引言 Ⅱ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 术语和定义、缩略语 1 ……………………………………………………………………………………… 3.1 术语和定义 1 ………………………………………………………………………………………… 3.2 缩略语 1 ……………………………………………………………………………………………… 4 方法概要 1 ………………………………………………………………………………………………… 5 实验材料及器材 2 ………………………………………………………………………………………… 6 环境条件 2 ………………………………………………………………………………………………… 7 DNA样品制备操作程序 2 ………………………………………………………………………………… 7.1 云母衬底的修饰 2 …………………………………………………………………………………… 7.2 DNA溶液的处理 2 …………………………………………………………………………………… 7.3 DNA在衬底上的固定 2 ……………………………………………………………………………… 7.4 DNA样品的保存 3 …………………………………………………………………………………… 8 DNA样品的检测及评价指标 3 …………………………………………………………………………… 8.1 检测 3 ………………………………………………………………………………………………… 8.2 评价指标 3 …………………………………………………………………………………………… 附录A(资料性附录) 样品的检测实例 4 ………………………………………………………………… A.1 原子力显微镜(AFM) 4 ……………………………………………………………………………… A.2 环境要求 4 …………………………………………………………………………………………… A.3 AFM探针 4 ………………………………………………………………………………………… A.4 典型DNA样品的AFM检测 4 …………………………………………………………………… 参考文献 7 ………………………………………………………………………………………………………GB/T32262—2015 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中国科学院提出。 本标准由全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC279)归口。 本标准主要起草单位:中国科学院上海应用物理研究所、上海交通大学、纳米技术及应用国家工程 研究中心。 本标准主要起草人:黄一波、胡钧、张益、孙洁林、李宾、李民乾、何丹农。 ⅠGB/T32262—2015 引 言 脱氧核糖核酸(DNA)是重要的遗传物质,而原子力显微镜(AFM)是高分辨检测和分析DNA的重 要工具。DNA分子呈链状结构,它的直径接近2nm。由于DNA分子自身和分子之间很容易粘连和团 聚,通常情况下,用于AFM实验的DNA分子需要分散固定在平整的衬底上,并且DNA分子与衬底间 需要有良好的结合才能承受清洗液的侵蚀和冲击。因此,需要标准的DNA样品制备方法,以利于 AFM观察和分析。本标准提供一种适合AFM检测分析用的DNA样品制备方法。 本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及到云母衬底的修饰[7.1条]具体内容与 专利号为ZL00116715.4[一种用于DNA操纵的云母衬底的制造方法]内容相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下, 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得: 专利持有人姓名:胡钧、黄一波、张益、欧阳振乾、李民乾 地址:上海市嘉定区嘉罗公路2019号 请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 ⅡGB/T32262—2015 用于原子力显微镜检测的脱氧核糖核酸 样品的制备方法 1 范围 本标准规定了用于AFM检测分析的DNA样品的制备方法,其中包括:方法概要、实验材料和器 材、环境条件、云母衬底的修饰、DNA溶液的处理、DNA在衬底上的固定、DNA样品的保存、DNA样品 的评价等。 本标准适用于制备利用AFM研究单个DNA分子的高分辨成像和纳米操纵实验的、吸附在原子级 平整的云母衬底上的各种DNA样品,以及研究其物化性质和生物学功能等。与DNA分子结构相类似 的生物材料的固定也可参照本标准。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义、缩略语 下列术语和定义、缩略语适用于本文件。 3.1 术语和定义 3.1.1 原子级平整 atomicallyflat 原子级属于微观结构,材料表面达到原子级水平的平整度。 3.2 缩略语 AFM:原子力显微镜(AtomicForceMicroscope) DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid) TE:三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二钠(TRIS-Ethylenediaminetetraaceticacid,disodiumSalt) APTES:(3-氨基丙基)-三乙氧基硅氧烷[(3-aminopropyl)triethoxysilane] 4 方法概要 4.1 根据AFM的工作原理。在进行样品观测时,应先将要探测的物质放置在一个衬底表面。 4.2 由于DNA分子非常小,所以要求将其放置在原子级平整且没有污染的衬底上。 4.3 本标准中利用DNA分子在水溶液中表面带负电荷的特性,对新解理的云母衬底进行修饰使其携 带正电荷,从而使得DNA通过静电相互作用牢固地吸附在云母衬底表面,以适合于后续的AFM检测 和分析研究。 1GB/T32262—2015 5 实验材料及器材 5.1 云母:规格为原子级平整。 5.2 DNA:纯度要求紫外吸收测试A260/A280≥1.7。 5.3 APTES:纯度≥98%。 5.4 TE缓冲液:分子生物学级别,pH7.0~pH8.0。 5.5 超纯水:符合GB/T6682—2008中一级水标准。 5.6 石蜡膜:通用实验室石蜡膜(ParafilmM􀆿all-purposelaboratoryfilm)。 5.7 超净工作台:净化等级满足百级。 6 环境条件 6.1 温度:环境温度应控制在10℃~35℃。 6.2 湿度:环境相对湿度应控制在20%~80%。 7 DNA样品制备操作程序 7.1 云母衬底的修饰 7.1.1 在超净工作条件下,将新解理的云母用超纯水淋洗1次,宜采用氮气吹干。 7.1.2 取新配置的1%(体积比)APTES水溶液置于石蜡膜上。APTES溶液的用量根据云母面积的大 小选取,宜1μL/cm2。 7.1.3 将云母解理面覆盖于APTES液滴上,放置2min。 7.1.4 用镊子夹取云母片,用超纯水淋洗后吹干。放置于80℃±5℃烘箱中30min,取出后放置于干 燥器中备用。所修饰的衬底要求表面无污染,推荐10μm2面积粗糙度(Rq)小于0.1nm。 7.2 DNA溶液的处理 7.2.1 将DNA原液分装成5μL/管~10μL/管,放置在-20℃±2℃环境下保存。 7.2.2 将冰箱中取出已分装的DNA原液,在室温下放置待其自然解冻后使用。 7.2.3 取解冻后的DNA原液用TE缓冲液稀释到10ng/μL~50ng/μL,并摇匀。 7.2.4 建议将稀释后的DNA溶液置于4℃±1℃环境下存放2d~15d。 7.2.5 从冰箱中取出经存放的DNA稀释液,使用前建议在室温下放置20min。 7.2.6 取DNA稀释液5μL~10μL(根据实验需要量定),用超纯水稀释10倍至最终浓度,摇匀。 7.2.7 将经稀释后的DNA溶液在37℃±2℃环境下温浴15min~30min。 7.3 DNA在衬底上的固定 7.3.1 静置法 7.3.1.1 在超净工作条件下,将20mm×20mm的石蜡膜平铺工作台上,取2μLDNA稀释液滴在石 蜡膜上。 7.3.1.2 将面积约为15mm×15mm的APTES修饰过的云母衬底覆盖在DNA溶液上,使DNA溶液 在云母衬底和石蜡膜之间均匀铺展,静置1min,使得DNA分子牢固地分散吸附到云母表面。 7.