书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 　 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２２２５９ — ２００８ 饲料中土霉素的测定 高效液相色谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狅狓狔狋犲狋狉犪犮狔犮犾犻狀犲犻狀犳犲犲犱狊 — 犎犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔 ２００８  ０８  ０１ 发布 ２００８  １１  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口 。 本标准起草单位 ： 农业部饲料质量监督检验测试中心 （ 南京 ）。 本标准主要起草人 ： 宋慧敏 、 耿士伟 、 冯三令 、 储瑞武 、 冯群科 、 贾书静 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２２２５９ — ２００８ 饲料中土霉素的测定 高效液相色谱法 １ 　 范围 本标准规定了饲料中土霉素含量的高效液相色谱测定方法 。 本标准适用于配合饲料 、 浓缩饲料 、 添加剂预混合饲料中土霉素的测定 ， 检出限为 ０．５ｍｇ ／ ｋｇ ， 定量 限为 ２ｍｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 　 动物饲料 　 试样的制备 ３ 　 原理 试样中土霉素经酸性溶液提取后 ， 注入高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分离 ， 用紫外检测器 （ 或二极管阵列检测器 ） 检测 ， 外标法计算土霉素的含量 。 ４ 　 试剂和溶液 除特殊说明外 ， 所用试剂均为分析纯 ， 水为蒸馏水 ， 色谱用水符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中一级用水规定 。 ４ ． １ 　 盐酸 ： 优级纯 。 ４ ． ２ 　 盐酸溶液 （ ０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 取盐酸 （ ４．１ ） ４．５ｍＬ ， 溶解于 １０００ｍＬ 水中 。 ４ ． ３ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ４ 　 磷酸二氢钠 。 ４ ． ５ 　 磷酸 。 ４ ． ６ 　 磷酸盐缓冲液 ： 取磷酸二氢钠 （ ４．４ ） １．２ｇ ， 加水使溶解并稀释至 １０００ｍＬ ， 用磷酸 （ ４．５ ） 调 ｐＨ 值 至 ３．５０ ， 摇匀 ， 过滤 。 ４ ． ７ 　 土霉素标准品 ： 纯度应大于 ９７．０％ 。 ４ ． ８ 　 土霉素标准贮备液 ： 准确称取已知纯度的土霉素标准品 ２０ｍｇ ， 置于 １００ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 用盐 酸溶液 （ ４．２ ） 溶解定容 、 摇匀 ， 其浓度为 ０．２ｍｇ ／ ｍＬ 。 贮存于 ４℃ 冰箱中 ， 溶液有效期 １ 个月 。 ４ ． ９ 　 土霉素标准曲线工作液 ： 分别准确移取标准贮备液 （ ４．８ ） ０．０５ 、 ０．５０ 、 ２．５０ 、 ７．５０ 、 １２．５ 、 ２５ｍＬ 于 １００ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 用水定容至刻度 。 该标准系列中土霉素的相应浓度分别为 ０．１ 、 １ 、 ５ 、 １５ 、 ２５ 、 ５０ μ ｇ ／ ｍＬ 。 现配现用 。 ５ 　 仪器和设备 ５ ． １ 　 分析天平 ： 感量 ０．０００１ｇ 。 ５ ． ２ 　 振荡器 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２２２５９ — ２００８ ５ ． ３ 　 超纯水处理器 。 ５ ． ４ 　 高效液相色谱仪 ： 紫外检测器 （ 或二极管阵列检测器 ）。 ５ ． ５ 　 ｐＨ 计 。 ５ ． ６ 　 ０．４５ μ ｍ 滤膜 。 ６ 　 试样制备 ６ ． １ 　 按 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 采样 。 ６ ． ２ 　 选取具有代表性的饲料样品至少 ５００ｇ ， 按 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 制备样品 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 试样溶液的制备 称取试样适量 （ 配合饲料 １０ｇ 、 浓缩饲料 ５ｇ 、 预混料 １ｇ ） 精确至 １ｍｇ 。 置于 ２５０ｍＬ 具塞锥形瓶 中 ， 准确加入 １００ｍＬ 盐酸溶液 （ ４．２ ）， 于振荡器上振荡提取 １０ｍｉｎ ， 溶液用滤纸过滤或用盐酸溶液 （ ４．２ ） 作适当稀释 ， 滤液过 ０．４５ μ ｍ 滤膜 （ ５．６ ）， 备用 。 ７ ． ２ 　 色谱条件 ７ ． ２ ． １ 　 色谱柱 ： Ｃ １８ 柱 ， 柱长 １５０ｍｍ ， 内径 ４．６ｍｍ ， 粒径为 ５ μ ｍ ， 或相当者 。 ７ ． ２ ． ２ 　 柱温 ： 室温 。 ７ ． ２ ． ３ 　 流动相 ： 磷酸缓冲液 （ ４．６ ） ＋ 乙腈 ＝８４＋１６ ， 混匀 ， 脱气 。 ７ ． ２ ． ４ 　 流速 ： １．０ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 ７ ． ２ ． ５ 　 检测器 ： 紫外检测器 （ 或二极管阵列检测器 ）， 检测波长 ３５３ｎｍ 。 ７ ． ２ ． ６ 　 进样量 ： ２０ μ Ｌ 。 ７ ． ３ 　 定量测定 按上述色谱条件 ， 分别将土霉素标准曲线工作液 （ ４．９ ） 及试样溶液 （ ７．１ ） 上机测定 ， 以单点或多点校 准 ， 以色谱峰面积积分值定量 。 ８ 　 结果计算 试样中土霉素的含量 （ 犡 ） 以质量分数 （ ｍｇ ／ ｋｇ ） 表示 ， 按式 （ １ ） 计算 ： 犡 ＝ 犮 狓 犿 × 犞 ………………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犡 ——— 试样中土霉素的含量 ， 单位为毫克每千克 （ ｍｇ ／ ｋｇ ）； 犮 狓 ——— 试样溶液中土霉素的含量 ， 单位为微克每毫升 （ μ ｇ ／ ｍＬ ）； 犿 ——— 试样质量 ， 单位为克 （ ｇ ）； 犞 ——— 样品的稀释液总体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）。 结果用平行测定的算术平均值表示 ， 保留三位有效数字 。 ９ 　 精密度 在重复性试验条件下两次平行测定结果的相对偏差不大于 １０％ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２２２５９ — ２００８ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 土霉素标准溶液图谱 图 犃 ． １ 　 土霉素标准溶液图谱 （ １ μ 犵 ／ 犿犔 ） 犌犅 ／ 犜 ２２２５９ — ２００８