书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２２１４７ — ２００８ 饲料中沙丁胺醇 、 莱克多巴胺和盐酸克仑 特罗的测定 　 液相色谱质谱联用法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狊犪犾犫狌狋犪犿狅犾 ， 狉犪犮狋狅狆犪犿犻狀犲犪狀犱犮犾犲狀犫狌狋犲狉狅犾犻狀犳犲犲犱狊 — 犔犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔犿犪狊狊狊狆犲犮狋狉狅犿犲狋狉狔 ２００８  ０６  ２７ 发布 ２００８  １０  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 。 本标准负责起草单位 ： 中国农业大学 、 农业部饲料效价与安全监督检验测试中心 （ 北京 ）。 本标准主要起草人 ： 张丽英 、 常碧影 、 贺平丽 、 董涛 、 杨文军 、 王宗义 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２２１４７ — ２００８ 饲料中沙丁胺醇 、 莱克多巴胺和盐酸克仑 特罗的测定 　 液相色谱质谱联用法 １ 　 范围 本标准规定了同步测定饲料中 β  激动剂沙丁胺醇 、 莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的液相色谱质谱联 用法 （ ＬＣＭＳ ） 法 。 本标准适用于配合饲料 、 浓缩饲料和添加剂预混合饲料中沙丁胺醇 、 莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的 测定 。 本标准中沙丁胺醇 、 莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的检测限均为 ０．０１ｍｇ ／ ｋｇ ， 定量限均为 ０．０５ｍｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 ３ 　 原理 试样经磷酸甲醇溶液提取 ， 用固相萃取柱净化后 ， 经反相 Ｃ １８ 柱梯度洗脱分离 ， 采用质谱检测器以 三种物质的质量色谱峰保留时间和特征离子定性 、 确证 ， 并用外标法定量 。 ４ 　 试剂和溶液 除特殊注明外 ， 本标准所用试剂均为分析纯 。 水符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 二级用水规定 。 ４ ． １ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ 　 甲醇 。 ４ ． ３ 　 磷酸甲醇提取液 ： 向 ３．９２ｇ 浓磷酸中加入 ２００ｍＬ 水 ， 再用甲醇定容到 １０００ｍＬ 。 ４ ． ４ 　 冰乙酸溶液 （ ２％ ）： １０ｍＬ 冰乙酸用水稀释至 ５００ｍＬ 。 ４ ． ５ 　 硫化钠溶液 （ １ｇ ／ Ｌ ）： 称取 ０．２５０ｇ 硫化钠 （ Ｎａ ２ Ｓ · ９Ｈ ２ Ｏ ） 用水溶解 ， 并定容至 ２５０ｍＬ 。 ４ ． ６ 　 ＳＰＥ 小柱淋洗液与洗脱液 ４ ． ６ ． １ 　 淋洗液 ： 移取 ９ｍＬ 浓盐酸于 １０００ｍＬ 水中 ， 摇匀 。 ４ ． ６ ． ２ 　 洗脱液 ： 移取 １０ｍＬ２５％ 的氨水于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用甲醇定容 。 ４ ． ７ 　 流动相 Ａ 液 ： 甲酸铵 ３．６５ｇ 溶于 ５００ｍＬ 去离子水中 ， 用甲酸调 ｐＨ 至 ３．８０ 。 Ｂ 液 ： 乙腈 ， 色谱纯 。 ４ ． ８ 　 沙丁胺醇 、 莱克多巴胺和盐酸克仑特罗标准溶液 ４ ． ８ ． １ 　 标准贮备液 ： 称取沙丁胺醇 、 莱克多巴胺和盐酸克仑特罗 （ 标准品含量均 ＞ ９８％ ） 各 ５０ｍｇ 分别 于 ５０ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 用甲醇溶解 ， 并定容至刻度 。 于冰箱中 ４℃ 保存 ， 保存期一个月 。 ４ ． ８ ． ２ 　 标准工作中间液 ： 移取沙丁胺醇 、 莱克多巴胺和盐酸克仑特罗标准贮备液 （ ４．８．１ ） 各 １ｍＬ 于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用冰乙酸溶液 （ ４．４ ） 定容 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２２１４７ — ２００８ ４ ． ８ ． ３ 　 标准工作液 ： 移取沙丁胺醇 、 莱克多巴胺和盐酸克仑特罗标准工作中间液 （ ４．８．２ ） 各 ０．５ ， １ ， ５ ， １０ｍＬ 于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用冰乙酸溶液 （ ４．４ ） 定容 。 ５ 　 仪器和设备 ５ ． １ 　 分析天平 ： 感量 ０．０００１ｇ 。 ５ ． ２ 　 聚丙烯离心管 ： ５０ｍＬ 。 ５ ． ３ 　 恒温水浴 ： 可保持水温至 ５５℃ 和 ７５℃ 。 ５ ． ４ 　 涡旋混合器 。 ５ ． ５ 　 酸度计 ： 准确至 ０．００１ 。 ５ ． ６ 　 离心机 。 ５ ． ７ 　 混合型阳离子交换 ＳＰＥ 小柱 。 ５ ． ８ 　 固相萃取 （ ＳＰＥ ） 减压净化系统 。 ５ ． ９ 　 液相色谱 ／ 质谱联用仪 。 ６ 　 试样制备 按照 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 规定方法采样 ， 采取样品量至少 ５００ｇ ， 以四分法缩减至 ２００ｇ ， 粉碎过 ４０ 目 筛 ， 充分混匀 ， 装瓶 ， 备用 。 ７ 　 测定 ７ ． １ 　 试样前处理 ７ ． １ ． １ 　 试样提取 准确称取适量试样 （ 配合饲料 ５ｇ ， 浓缩饲料 ２ｇ ， 添加剂预混合饲料 １ｇ ， 准确至 ０．０００１ｇ ） 于 ５０ｍＬ 离心管 ， 用磷酸甲醇提取液 （ ４．３ ） ４０ｍＬ ， 振摇提取 ３０ｍｉｎ ， 然后于离心机上以 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 。 上清液倒入 １００ｍＬ 容量瓶 ， 残渣再用上述提取液 （ ４．３ ） ４０ｍＬ 、 ２０ｍＬ ， 重复提取 ２ 次 ， 每次振 摇 ５ｍｉｎ ～ １０ｍｉｎ ， 于离心机上以 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 后 ， 合并上清液于 １００ｍＬ 容量瓶中 。 最后用 提取液 （ ４．３ ） 定容 ， 混匀 ， 过滤 。 ７ ． １ ． ２ 　 净化 ７ ． １ ． ２ ． １ 　 配合饲料和浓缩饲料 ： 吸取一定体积试样提取液滤液 （ 配合饲料 １ｍＬ ， 浓缩饲料 ０．５ｍＬ ） 于 ５ｍＬ 试管中 ， 置 ５５℃ 水浴中以氮气吹至近干 。 同时将固相萃取柱 （ ５．７ ） 固定于 ＳＰＥ 减压净化系统 （ ５．８ ） 上 ， 依次用 １ｍＬ 甲醇和 １ｍＬ 水活化 、 平衡 。 向试管中加入冰乙酸溶液 （ ４．４ ） １ｍＬ ， 涡旋振荡 ， 然 后全部加到小柱上 ， 控制过柱速度不超过的 １ｍＬ ／ ｍｉｎ ， 分别用 １ｍＬ 淋洗液 （ ４．６．１ ） 和 １ｍＬ 甲醇淋洗 一次 ， 最后用 １ｍＬ 洗脱液 （ ４．６．２ ） 洗脱 ， 洗脱速度不超过 １ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 洗脱液于 ５５℃ 水浴中 ， 用氮气吹 干 ， 准确加入 １．００ｍＬ 冰乙酸溶液 （ ４．４ ） 充分溶解混匀 ， 并转移到上机样品瓶中 ， 盖好 ， 备用 。 ７ ． １ ． ２ ． ２ 　 添加剂预混合饲料 ： 取提取液 ０．２ｍＬ ， 加硫化钠溶液 （ ４．５ ） ０．１ｍＬ ， 涡旋振荡 ， 然后加入冰乙 酸 （ ４．４ ） ４ｍＬ ， 涡旋振荡 ， 于离心机上以 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 再取 １ｍＬ 上清液按照 ７．１．２．１ 步骤 过固相萃取柱 （ ５．７ ） 净化 。 ７ ． ２ 　 测定 ７ ． ２ ． １ 　 色谱条件 色谱柱 ： Ｃ １８ 柱 ， 内径 ２．１ｍｍ ， 柱长 １５０ｍｍ ， 填充物粒度 ３ μ ｍ 。 柱温 ： 室温 。 流动相 ： 流动相 Ａ ： 甲酸铵缓冲溶液 （ ４．７ ）， 流动相 Ｂ ： 乙腈 （ ４．１ ）。 梯度洗脱程序见表 １ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２２１４７ — ２００８ 表 １ 　 梯度洗脱程序 时间 ／ ｍｉｎ 流动相 Ａ ／ ％ 流动相 Ｂ ／ ％ ０ ９８ ２ ５ ７０ ３０ １５ ５０ ５０ 　　 每次进样间隔用流动相 Ａ＋Ｂ＝９８＋２ ， 平衡 １０ｍｉｎ 。 流速 ： ０．２０ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 进样体积 ： ２０ μ Ｌ 。 ７ ． ２ ． ２ 　 质谱条件 采用电喷雾正离子 （ ＥＳＩ＋ ） 模式做选择离子检测 ， 选择离子为 ： 沙丁胺醇 ： ｍ ／ ｚ２４０ ， ｍ ／ ｚ２２２ ， ｍ ／ ｚ１６６ ； 莱克多巴胺 ： ｍ ／ ｚ３０２ ， ｍ ／ ｚ２８４ ， ｍ ／ ｚ１６４ ； 盐酸克仑特罗 ： ｍ ／ ｚ２７７ ， ｍ ／ ｚ２５９ ， ｍ ／ ｚ２０３ 。 源温度 ： １２０℃ 。 取样锥孔电压 ： ２５Ｖ 。 萃取锥孔电压 ： ５Ｖ 。 脱溶剂氮气温度 ： ３００℃ 。 脱溶剂氮气流速 ： ３００Ｌ ／ ｈ 。 ７ ． ２ ． ３ 　 定性定量方法 ７ ． ２ ． ３ ． １ 　 定性 通过样品总离子流色谱图上沙丁胺醇 （ ｍ ／ ｚ２４０ ， ｍ ／ ｚ２２２ ， ｍ ／ ｚ１６６ ）、 莱克多巴胺 （ ｍ ／ ｚ３０２ ， ｍ ／ ｚ２８４ ， ｍ ／ ｚ１６４ ） 和盐酸克仑特罗 （ ｍ ／ ｚ２７７ ， ｍ ／ ｚ２５９ ， ｍ ／ ｚ２０３ ） 的保留时间和各色谱峰对应的特征离子 ， 与标准 品相应的保留时间和各色谱峰对应的特征离子进行对照定性 。 样品与标准品保留时间的相对偏差不大 于 ０．５％ 。 每种药物的 ３ 个特征离子基峰百分数