书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ５ — ２０１８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．５ — ２００８ 鲤春病毒血症诊断规程 犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳犱犻犪犵狀狅狊犻狊犳狅狉狊狆狉犻狀犵狏犻狉犪犲犿犻犪狅犳犮犪狉狆 ２０１８  １２  ２８ 发布 ２０１９  ０７  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准代替 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．５ — ２００８ 《 鱼类检疫方法 　 第 ５ 部分 ： 鲤春病毒血症病毒 （ ＳＶＣＶ ）》。 与 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．５ — ２００８ 相比 ， 除编辑性修改外 ， 主要技术变化如下 ： ——— 增加了缩略语 ； ——— 增加了酶联免疫吸附试验 （ ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ ， ＥＬＩＳＡ ） 检测鲤春病毒血症病毒 （ ｓｐｒｉｎｇｖｉｒａｅｍｉａｏｆｃａｒｐｖｉｒｕｓ ， ＳＶＣＶ ） 抗原的方法 ； ——— 增加了间接免疫荧光抗体试验 （ ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｔｅｓｔ ， ＩＦＡＴ ） 检测 ＳＶＣＶ 抗原的方法 ； ——— 增加了实时定量 ＰＣＲ （ ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ ） 检测 ＳＶＣＶ 核酸的方法 ； ——— 增加了鲤春病毒血症 （ ｓｐｒｉｎｇｖｉｒａｅｍｉａｏｆｃａｒｐ ， ＳＶＣ ） 的综合判定 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出 。 本标准由全国水产标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１５６ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 宁波市海洋与渔业研究院 、 全国水产技术推广总站 、 中华人民共和国北京海关 、 中华人民共和国蛇口海关 。 本标准主要起草人 ： 王建平 、 张利峰 、 江育林 、 徐胜威 、 高隆英 、 吴雄飞 、 陈爱平 、 沈伟良 。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．１ — １９９５ ； ——— ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．５ — ２００８ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ５ — ２０１８ 鲤春病毒血症诊断规程 １ 　 范围 本标准规定了鲤春病毒血症的采样 、 病毒分离培养 、 ＲＴＰＣＲ 、 实时定量 ＲＴＰＣＲ 、 酶联免疫吸附试验 、 间接免疫荧光抗体试验 、 综合判定的方法 。 本标准适用于鲤春病毒血症的流行病学调查 、 诊断 、 检疫和疫情监测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＳＣ ／ Ｔ７１０３ 　 水生动物产地检疫采样技术规范 ３ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＣＯ ： 草鱼卵巢细胞系 （ ｇｒａｓｓｃａｒｐｏｖａｒｙｃｅｌｌｌｉｎｅ ） ＣＰＥ ： 细胞病变效应 （ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ ） ＥＢ ： 溴化乙锭 （ ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ） ＥＬＩＳＡ ： 酶联免疫吸附试验 （ ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ ） ＥＰＣ ： 鲤上皮瘤细胞系 （ ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａｐａｐｕｌｏｓｕｍｃｙｐｒｉｎｉｃｅｌｌｌｉｎｅ ） ＦＣＳ ： 胎牛血清 （ ｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｒｕｍ ） ＦＨＭ ： 胖头 /G21 肌肉细胞系 （ ｆａｔｈｅａｄｍｏｎｎｏｗｃｅｌｌｌｉｎｅ ） ＦＩＴＣ ： 异硫氰酸荧光素 （ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ） Ｇ 蛋白 ： 糖蛋白 （ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ） ＩＦＡＴ ： 间接免疫荧光抗体试验 （ ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｔｅｓｔ ） ＲＴＰＣＲ ： 逆转录  聚合酶链式反应 （ ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） ＳＶＣ ： 鲤春病毒血症 （ ｓｐｒｉｎｇｖｉｒａｅｍｉａｏｆｃａｒｐ ） ＳＶＣＶ ： 鲤春病毒血症病毒 （ ｓｐｒｉｎｇｖｉｒａｅｍｉａｏｆｃａｒｐｖｉｒｕｓ ） ４ 　 试剂和材料 ４ ． １ 　 水 ： 符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中一级水的规格 ； 核酸抽提和 ＲＴＰＣＲ 应使用无 ＲＮＡ 酶的去离子水 。 ４ ． ２ 　 ＳＶＣＶ 参考株 ： 由中华人民共和国农业农村部相关部门指定单位提供 。 ４ ． ３ 　 鱼类细胞系 ： ＥＰＣ 、 ＦＨＭ 、 ＣＯ 。 ４ ． ４ 　 鱼类细胞生长液 ： 用 Ｅａｒｌｅ ’ ｓ 平衡盐的 Ｍ１９９ 培养基配制 ， 另加 １０％ 胎牛血清 （ ＦＣＳ ）。 ４ ． ５ 　 鱼类细胞维持液 ： 用 Ｅａｒｌｅ ’ ｓ 平衡盐的 Ｍ１９９ 培养基配制 ， 另加 ２％ＦＣＳ 。 ４ ． ６ 　 细胞消化液 ： 见附录 Ａ 中 Ａ．１ 。 １ 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ５ — ２０１８ ４ ． ７ 　 ＨＥＰＥＳ （ Ｎ２ 羟乙基哌嗪 Ｎ′２ 乙磺酸 ）。 ４ ． ８ 　 逆转录酶 ＡＭＶ ： －２０℃ 保存 ， 避免反复冻融或温度剧烈变化 。 ４ ． ９ 　 ＲＮＡ 酶抑制剂 （ ＲＮａｓｉｎ 或 ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ ）： －２０℃ 保存 ， 避免反复冻融或温度剧烈变化 。 ４ ． １０ 　 ＲＴＰＣＲ 逆转录酶浓缩缓冲液 、 Ｔａｑ 酶用浓缩缓冲液 ： 分别见 Ａ．２ 、 Ａ．３ 。 ４ ． １１ 　 ＭｇＣｌ ２ ： ２５ｍｍｏｌ ／ Ｌ 。 ４ ． １２ 　 ｄＮＴＰ ： 含 ｄＣＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＡＴＰ 、 ｄＴＴＰ 各 １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ ， －２０℃ 保存 。 ４ ． １３ 　 Ｔａｑ 酶 ： －２０℃ 保存 ， 避免反复冻融或温度剧烈变化 。 ４ ． １４ 　 无水乙醇 ： 分析纯 ， 使用前预冷到 －２０℃ 。 ４ ． １５ 　 ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２０００ 。 ４ ． １６ 　 琼脂糖 。 ４ ． １７ 　 ＴＢＥ 电泳缓冲液 ： 见 Ａ．４ 。 ４ ． １８ 　 引物和探针 ： 参照 ＯＩＥ 《 水生动物疾病诊断手册 》 ２０１６ 年版 ， ＳＶＣＶ 糖蛋白 （ Ｇ 蛋白 ） 基因片段 （ 参见附录 Ｂ ） 及 ＳＮ ／ Ｔ１１５２ 。 ＲＴＰＣＲ 和实时定量 ＲＴＰＣＲ 检测 ＳＶＣＶ 的引物和探针如下 ： ａ ） 　 ＰＣＲ 扩增 ＳＶＣＶＧ 蛋白 ７１４ｂｐ 片段的引物 ， 嵌套 ＰＣＲ 扩增 ６０６ｂｐ 片段的引物 。 使用时浓度为 ４０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 。 引物按以下序列合成 ： ＲＴＰＣＲ 引物 ： 正向引物 Ｆ１ ： ５′ＴＣＴＴＧＧＡＧＣＣＡＡＡＴＡＧＣＴＣＡＲＲＴＣ３′ ； 反向引物 Ｒ２ ： ５′ＡＧＡＴＧＧＴＡＴＧＧＡＣＣＣＣＡＡＴＡＣＡＴＨＡＣＮＣＡＹ３′ ； 嵌套 ＰＣＲ 引物 ： 正向引物 Ｆ１ ： ５′ＴＣＴＴＧＧＡＧＣＣＡＡＡＴＡＧＣＴＣＡＲＲＴＣ３′ ； 反向引物 Ｒ４ ： ５′ＣＴＧＧＧＧＴＴＴＣＣＮＣＣＴＣＡＡＡＧＹＴＧＹ３′ 。 ｂ ） 　 实时定量 ＲＴＰＣＲ 检测 ＳＶＣＶ 的引物和探针 ， 按以下序列合成 ： 引物 ３９１ｕ１ ： ５′ＡＴＣＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＡＧ３′ ； 引物 ３９１ｒ１ ： ５′ＣＡＴＡＴＧＧＣＴＣＴＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＡＡ３′ ； 探针 ： ５′ （ ＦＡＭ ） ＴＣＣＣＣＣＴＣＡＡＡＧＴＴＧＣＧＧＡＴＧＧ （ ＴＡＭＲＡ ） ３′ 。 ４ ． １９ 　 包被稀释液 ： ｐＨ９．６ 、 ０．０２ｍｏｌ ／ Ｌ 的碳酸盐缓冲液 （ 见 Ａ．５ ）。 ４ ． ２０ 　 羊抗 ＳＶＣＶ 免疫球蛋白 （ Ｉｇ ）： 由中华人民共和国农业农村部有关部门指定机构提供 ， 并经过实验确认 。 ４ ． ２１ 　 鼠抗 ＳＶＣＶ 的单克隆抗体 ： 由中华人民共和国农业农村部有关部门指定机构提供 ， 并经过实验确认 。 ４ ． ２２ 　 辣根过氧化物酶 （ ＨＲＰ ） 标记的抗鼠抗体 。 ４ ． ２３ 　 封闭液 ： １％ 明胶 （ 用包被液配制 ）。 ４ ． ２４ 　 终止液 ： ２ｍｏｌ ／ Ｌ 的硫酸 。 ４ ． ２５ 　 异硫氰酸荧光素 （ ＦＩＴＣ ） 标记的抗鼠抗体 。 ４ ． ２６ 　 样品缓冲液 ： 见 Ａ．６ 。 ５ 　 器材和设备 ５ ． １ 　 倒置显微镜 。 ５ ． ２ 　 生化培养箱 。 ５ ． ３ 　 普通冰箱和超低温冰箱 。 ５ ． ４ 　 组织研磨器 。 ５ ． ５ 　 冷冻离心机和离心管 。 ２ 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ５ — ２０１８ ５ ． ６ 　 ＰＣＲ 仪 、 荧光 ＰＣＲ 仪 。 ５ ． ７ 　 电泳仪 。 ５ ． ８ 　 微量移液器 。 ５ ． ９ 　 紫外透射仪或凝胶成像仪 。 ５ ． １０ 　 高压灭菌锅 。 ５ ． １１ 　 微波炉 ５ ． １２ 　 水浴锅 。 ５ ． １３ 　 制冰机 。 ５ ． １４ 　 磁力搅拌