书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ２ — ２０１７ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．２ — ２００８ 传染性造血器官坏死病诊断规程 犇犻犪犵狀狅狊犻狊狅犳犻狀犳犲犮狋犻狅狌狊犺犪犲犿犪狋狅狆狅犻犲狋犻犮狀犲犮狉狅狊犻狊 ２０１７  １１  ０１ 发布 ２０１８  ０５  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准代替 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．２ — ２００８ 《 鱼类检疫方法 　 第 ２ 部分 ： 传染性造血器官坏死病毒 （ ＩＨＮＶ ）》。 本标准与 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．２ — ２００８ 相比 ， 除编辑性修改外 ， 主要技术变化如下 ： ——— 修改了标准名称 ； ——— 增加了缩略语 （ 见第 ３ 章 ）； ——— 删除了 ＰＣＲ 扩增 ＩＨＮＶ７８６ｂｐ 、 套式 ＰＣＲ 扩增 ＩＨＮＶ３２３ｂｐ 方法 （ 见 ２００８ 年版 ３．７ ）； ——— 增加了扩增 ＩＨＮＶ６９３ｂｐ 的方法 （ 见 ４．１０ ）； ——— 增加了酶联免疫吸附试验 （ 见 ８．３ ）； ——— 增加了间接免疫荧光抗体试验 （ 见 ８．４ ）； ——— 增加了综合判定 （ 见第 ９ 章 ）； ——— 增加了传染性造血器官坏死病 （ ＩＨＮ ）（ 见附录 Ｃ ）。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国水产标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１５６ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 浙江省宁波市海洋与渔业研究院 、 深圳市检验检疫科学研究院 、 全国水产技术推广总站 、 北京出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 王建平 、 沈伟良 、 高隆英 、 张利峰 、 吴雄飞 、 江育林 、 陈爱平 、 乐韵 。 本标准代替 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．２ — ２００８ 。 本标准所代替标准历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．１ — １９９５ ； ——— ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．２ — ２００８ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ２ — ２０１７ 传染性造血器官坏死病诊断规程 １ 　 范围 本标准规定了传染性造血器官坏死病毒经细胞分离培养后通过逆转录聚合酶链式反应 、 酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光抗体试验鉴定的方法 。 本标准适用于传染性造血器官坏死病的流行病学调查 、 诊断 、 检疫和疫情监测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１８０８８ 　 出入境动物检疫采样 ＳＣ ／ Ｔ７１０３ 　 水生动物产地检疫采样技术规范 ３ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＣＰＥ ： 细胞病变效应 （ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ ） ＥＬＩＳＡ ： 酶联免疫吸附试验 （ ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ ） ＥＰＣ ： 鲤上皮瘤细胞系 （ ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａｐａｐｕｌｏｓｕｍｃｙｐｒｉｎｉｃｅｌｌｌｉｎｅ ） ＦＣＳ ： 胎牛血清 （ ｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｒｕｍ ） ＦＨＭ ： 胖头 /G21 肌肉细胞系 （ ｆａｔｈｅａｄｍｏｎｎｏｗｃｅｌｌｌｉｎｅ ） Ｇ 蛋白 ： 糖蛋白 （ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ） ＨＥＰＥＳ ： ４ 羟乙基哌嗪乙磺酸 ［ ４ （ ２ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ） ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ１ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ ］ ＩＦＡＴ ： 间接免疫荧光抗体试验 （ ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｔｅｓｔ ） ＩＨＮ ： 传染性造血器官坏死病 （ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓ ） ＩＨＮＶ ： 传染性造血器官坏死病毒 （ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ ） ＲＴＰＣＲ ： 逆转录  聚合酶链式反应 （ ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） ＰＢＳ ： 磷酸缓冲盐溶液 （ ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒＳａｌｉｎｅ ） ＰＢＳＴ ： 磷酸缓冲盐吐温溶液 （ ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒＳａｌｉｎＴｗｅｅｎ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ ） ＦＩＴＣ ： 异硫氰酸荧光素 （ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ） ４ 　 试剂和材料 除非另有规定 ， 仅使用分析纯试剂 。 ４ ． １ 　 水 ： ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中一级水 ， 核酸抽提和 ＲＴＰＣＲ 应使用无 ＲＮＡ 酶的去离子水 。 ４ ． ２ 　 ＩＨＮＶ 参考株 ： 由国家主管部门指定机构提供 。 １ 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ２ — ２０１７ ４ ． ３ 　 鱼类细胞系 ： ＥＰＣ 、 ＦＨＭ 。 ４ ． ４ 　 细胞生长液 ： 用 Ｅａｒｌｅ ’ ｓ 平衡盐的 Ｍ１９９ 培养基配制 ， 另加 １０％ 胎牛血清 （ ＦＣＳ ）。 ４ ． ５ 　 细胞维持液 ： 用 Ｅａｒｌｅ ’ ｓ 平衡盐的 Ｍ１９９ 培养基配制 ， 另加 ２％ＦＣＳ 。 ４ ． ６ 　 细胞消化液 ： 见 Ａ．１ 。 ４ ． ７ 　 ＨＥＰＥＳ （ 犖 ２  羟乙基哌嗪 犖 ′２ 乙磺酸 ）。 ４ ． ８ 　 犜犪狇 酶 ： －２０℃ 保存 ， 避免反复冻融或温度剧烈变化 。 ４ ． ９ 　 ｄＮＴＰ ： 含 ｄＣＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＡＴＰ 、 ｄＴＴＰ 各 １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ 。 ４ ． １０ 　 引物 ： 依据 ＩＨＮＶ 糖蛋白 （ Ｇ 蛋白 ） 基因片段序列设计引物 ， 扩增其中 ６９３ｂｐ 片段 （ 参见附录 Ｂ ）。 正向引物 Ｆ１ ： ５′ＡＧＡＧＡＴＣＣＣＴＡＣＡＣＣＡＧＡＧＡＣ３′ ； 反向引物 Ｒ２ ： ５′ＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＴＣＣＧＴＧＣＡＡ３′ 。 ４ ． １１ 　 无水乙醇 ： 分析纯 ， 使用前预冷到 －２０℃ 。 ４ ． １２ 　 ＡＭＶ 逆转录酶 ： －２０℃ 保存 ， 避免反复冻融或温度剧烈变化 。 ４ ． １３ 　 ＲＮＡ 酶抑制剂 ： －２０℃ 保存 ， 避免反复冻融或温度剧烈变化 。 ４ ． １４ 　 逆转录酶缓冲液和 犜犪狇 酶缓冲液 ： 分别见 Ａ．２ 、 Ａ．３ 。 ４ ． １５ 　 ＤＮＡ 分子量标准 （ ＤＮＡＭａｒｋｅｒ ）。 ４ ． １６ 　 琼脂糖 。 ４ ． １７ 　 ＴＢＥ 电泳缓冲液 ： 见 Ａ．４ 。 ４ ． １８ 　 包被稀释液 ： ０．０２ｍｏｌ ／ Ｌ 、 ｐＨ＝９．６ 的碳酸盐缓冲液 （ 见 Ａ．５ ）。 ４ ． １９ 　 羊抗 ＩＨＮＶ 免疫球蛋白 （ Ｉｇ ）： 由动物防疫管理部门指定单位提供 。 ４ ． ２０ 　 鼠抗 ＩＨＮＶ 的单克隆抗体 ： 由动物防疫管理部门指定单位提供 。 ４ ． ２１ 　 辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体 。 ４ ． ２２ 　 封闭液 。 ４ ． ２４ 　 ＦＩＴＣ 标记的抗鼠抗体 。 ４ ． ２５ 　 样品缓冲液 ： 见 Ａ．６ 。 ４ ． ２６ 　 氯化镁溶液 ： 见 Ａ．７ 。 ５ 　 器材和设备 ５ ． １ 　 ２４ 孔 、 ９６ 孔细胞培养板 、 细胞培养瓶 。 ５ ． ２ 　 倒置荧光显微镜 。 ５ ． ３ 　 恒温培养箱 。 ５ ． ４ 　 冰箱 。 ５ ． ５ 　 微量可调移液器及吸头 。 ５ ． ６ 　 离心机和离心管 。 ５ ． ７ 　 ＰＣＲ 扩增仪 。 ５ ． ８ 　 水平电泳仪 。 ５ ． ９ 　 紫外透射仪或凝胶成像仪 。 ５ ． １０ 　 高压灭菌锅 。 ５ ． １１ 　 水浴锅 。 ５ ． １２ 　 制冰机 。 ５ ． １３ 　 磁力搅拌器 。 ５ ． １４ 　 培养液过滤器 。 ５ ． １５ 　 酶标仪 。 ２ 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ２ — ２０１７ ６ 　 临床症状 临床症状见附录 Ｃ 。 ７ 　 样品采集及处理 ７ ． １ 　 样品采集 ７ ． １ ． １ 　 产地采样 应在水温低于 １８℃ 进行 ， 采样数量应符合 ＳＣ ／ Ｔ７１０３ 的要求 。 ７ ． １ ． ２ 　 采样对象 鲑 、 鳟等易感鱼类 。 ７ ． １ ． ３ 　 样品采样 按 ＧＢ ／ Ｔ１８０８８ 的规定执行 ， 对有临床症状的鱼 ， 体长 ≤ ４ｃｍ 的鱼苗取整条 ， 若是带卵黄囊的鱼应 去掉卵黄囊 ； 体长 ４ｃｍ ～ ６ｃｍ 的鱼取内脏 （ 包括肾 ）； 体长大于 ６ｃｍ 的鱼则取肝 、 肾和脾 。 对无症状的鱼取肝 、 肾 、 脾 ； 亲鱼取卵巢液和精液 ； 鱼卵则取卵膜 。 ７ ． ２ 　 样品保藏及运送 样品需采集活的易感鱼类 ， 并尽可能采集带有疾病症状的易感鱼 。 运送过程需充氧以保持鱼类的存活 ， 尽快送到实验室 ； 取鱼组织需在 ４℃ 下冷藏 ２４ｈ 内送达实验室 。 ８ 　 病毒分离和鉴定 ８ ． １ 　 病毒分离培养 ８ ． １ ． １ 　 样