书 书 书中华人民共和国国家标准 犌犅 ５４１３ ． ２０ — ２０２２ 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定 ２０２２  ０６  ３０ 发布 ２０２２  １２  ３０ 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布书 书 书犌犅 ５４１３ ． ２０ — ２０２２ Ⅰ 　　　　前 　　 言 　　 本标准代替 ＧＢ５４１３．２０ — ２０１３ 《 食品安全国家标准 　 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定 》。 本标准与 ＧＢ５４１３．２０ — ２０１３ 相比 ， 主要变化如下 ： ——— 删除了第二法雷氏盐分光光度法 ， 增加了离子色谱法作为第二法 ； ——— 增加了液相色谱  串联质谱法作为第三法 。犌犅 ５４１３ ． ２０ — ２０２２ １ 　　　　食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定 １ 　 范围 本标准规定了婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定方法 。 本标准适用于婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定 。 第一法 　 酶比色法 ２ 　 原理 试样经酸水解 ， 再经酶作用后与显色剂反应生成有色物质 ， 在一定浓度范围内 ， 其颜色的深浅与胆 碱含量成正比 ， 外标法定量 。 ３ 　 试剂和材料 除非另有说明 ， 本方法所用试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的三级水 。 ３ ． １ 　 试剂 ３ ． １ ． １ 　 三羟甲基氨基甲烷 ［（ ＣＨ ２ ＯＨ ） ３ ＣＮＨ ２ ］。 ３ ． １ ． ２ 　 苯酚 （ Ｃ ６ Ｈ ５ ＯＨ ）。 ３ ． １ ． ３ 　 浓盐酸 （ ＨＣｌ ）。 ３ ． １ ． ４ 　 氢氧化钠 （ ＮａＯＨ ）。 ３ ． １ ． ５ 　 胆碱氧化酶 ： ≥ １０Ｕ ／ ｍｇ ， 置于 －２０℃ 保存 。 ３ ． １ ． ６ 　 过氧化物酶 ： ≥ ２５０Ｕ ／ ｍｇ ， 置于 ２℃ ～ ８℃ 保存 。 ３ ． １ ． ７ 　 ４ 氨基安替比林 （ Ｃ １１ Ｈ １３ Ｎ ３ Ｏ ）。 ３ ． １ ． ８ 　 磷脂酶 Ｄ ： ≥ ６０Ｕ ／ ｍｇ ， 置于 －２０℃ 保存 。 ３ ． ２ 　 试剂配制 ３ ． ２ ． １ 　 盐酸溶液 （ １ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 量取 ８５ｍＬ 浓盐酸注入约 ９００ｍＬ 水中 ， 稀释至 １０００ｍＬ 。 ３ ． ２ ． ２ 　 盐酸溶液 （ ３ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 量取 ２５０ｍＬ 浓盐酸注入约 ６００ｍＬ 水中 ， 稀释至 １０００ｍＬ 。 ３ ． ２ ． ３ 　 三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液 （ Ｔｒｉｓ ）（ ０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 准确称取 ６．０５７ｇ 三羟甲基氨基甲烷溶于 ５００ｍＬ 水中 ， 用盐酸溶液 （ １ｍｏｌ ／ Ｌ ） 调 ｐＨ 至 ８．０±０．２ ， 再用水定容至 １０００ｍＬ 。 此溶液在 ４℃ 冰箱中可保存 １ 个月 。 ３ ． ２ ． ４ 　 显色剂 ： 取 １２０Ｕ 的胆碱氧化酶 、 ２８０Ｕ 的过氧化物酶 、 １００Ｕ 的磷脂酶 Ｄ 、 １５ｍｇ４ 氨基安替比 林和 ５０ｍｇ 苯酚置于 １００ｍＬ 的容量瓶中 ， 用 ０．０５ｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓ 缓冲溶液溶解并定容 。 临用现配 。 ３ ． ２ ． ５ 　 氢氧化钠溶液 （ ５００ｇ ／ Ｌ ）： 称取 ５００ｇ 氢氧化钠 ， 溶于水并稀释至 １０００ｍＬ ， 采用塑料容器储存 。犌犅 ５４１３ ． ２０ — ２０２２ ２ 　　　　 ３ ． ３ 　 标准品 胆碱酒石酸氢盐标准品 （ Ｃ ９ Ｈ １９ ＮＯ ７ ， 相对分子质量 ： ２５３．２５ ， ＣＡＳ 号 ： ８７６７２ ）： 纯度 ≥ ９９％ ， 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 。 ３ ． ４ 　 标准溶液配制 ３ ． ４ ． １ 　 胆碱 （ 以胆碱氢氧化物计 ， 相对分子质量 １２１．１８ ） 标准储备溶液 （ ２５００ｍｇ ／ Ｌ ）： 准确称取在 １０２℃±２℃ 烘至恒重的胆碱酒石酸氢盐 ５２２．５ｍｇ ， 用水溶解并转移至 １００ｍＬ 容量瓶中定容 ， 混匀 。 ４℃ 以下避光保存 ， 有效期 ３ 个月 。 ３ ． ４ ． ２ 　 胆碱标准工作溶液 （ ２５０ｍｇ ／ Ｌ ）： 吸取 １０．０ｍＬ 胆碱标准储备溶液于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用水定容 ， 混匀 ， ４℃ 以下避光保存 ， 有效期 １ 个月 。 ３ ． ５ 　 材料 ３ ． ５ ． １ 　 ０．４５ μ ｍ 水性滤膜针头滤器 。 ３ ． ５ ． ２ 　 注射器 ： ５ｍＬ 或相当者 。 ４ 　 仪器和设备 ４ ． １ 　 分析天平 ： 感量分别为 ０．１ｍｇ 和 ０．００１ｇ 。 ４ ． ２ 　 恒温水浴装置 ： 温度可控制在 ７０℃±２℃ 和 ３７℃±２℃ 。 ４ ． ３ 　 ｐＨ 计 ： 精度 ０．０１ 。 ４ ． ４ 　 分光光度计 。 ５ 　 分析步骤 ５ ． １ 　 样品前处理 ５ ． １ ． １ 　 样品预处理 准确称取 ２０ｇ （ 精确至 ０．００１ｇ ） 混合均匀的液态试样于 １００ｍＬ 锥形瓶中 ， 加入 ３ｍｏｌ ／ Ｌ 的盐酸溶液 １０ｍＬ ， 加塞混匀 。 准确称取 ５ｇ （ 精确至 ０．００１ｇ ） 混合均匀的半固态或固态试样于 １００ｍＬ 锥形瓶中 ， 加入 １ｍｏｌ ／ Ｌ 的盐酸溶液 ３０ｍＬ ， 加塞混匀 。 ５ ． １ ． ２ 　 水解 将装有试样的容器放在 ７０℃±２℃ 水浴中 ， 放置 ３ｈ （ 每隔 ３０ｍｉｎ 振摇一次 ）， 冷却至室温 。 用氢氧化钠溶液 （ ５００ｇ ／ Ｌ ） 调 ｐＨ 至 ３．５ ～ ４．０ ， 转入 ５０ｍＬ 容量瓶中 ， 用水定容至刻度 。 ５ ． １ ． ３ 　 过滤 用滤纸过滤水解液 ， 若滤液不澄清 ， 用 ０．４５ μ ｍ 水性滤膜针头滤器再次过滤 。 收集滤液待测 。 ５ ． ２ 　 测定 ５ ． ２ ． １ 　 标准曲线的制作 分别吸取 ２．００ｍＬ 、 ４．００ｍＬ 、 ６．００ｍＬ 、 ８．００ｍＬ 、 １０．００ｍＬ 胆碱标准工作溶液 （ ２５０ｍｇ ／ Ｌ ） 于 １０ｍＬ