中华人民共和国国家标准 GB5009.274—2016 食品安全国家标准 水产品中西加毒素的测定 2016-12-23发布 2017-06-23实施 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局发布GB5009.274—2016 Ⅰ 前 言 本标准代替SN/T3038—2011《出口海产品中西加毒素的检测 小鼠生物法》和SN/T3869— 2014《出口水产品中雪卡毒素的测定》。 本标准与SN/T3038—2011和SN/T3869—2014相比,主要变化如下: ———标准名称修改为“食品安全国家标准水产品中西加毒素的测定”; ———保留小鼠生物法为第一法,增加液相色谱-串联质谱法为第二法。GB5009.274—2016 1 食品安全国家标准 水产品中西加毒素的测定 1 范围 本标准规定了水产品中西加毒素的测定方法。 本标准适用于水产品可食部分中西加毒素的测定。 第一法 小鼠生物法 2 原理 用丙酮提取水产品中西加毒素,提取物经减压蒸干后,再以1%吐温-60生理盐水为分散介质,制备 西加毒素-1%吐温-60生理盐水混悬液,将该混悬液注射入小鼠腹腔,观察小鼠存活情况,根据西加毒素 致小鼠死亡时间和鼠单位的关系表查出对应的鼠单位,并按小鼠体重校正鼠单位,计算确定西加毒素含 量(鼠单位毒力)。 3 试剂和材料 除非另有说明,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。 3.1 试剂 3.1.1 吐温60(C64H126O26)。 3.1.2 苦味酸[HO-C6H2(NO2)3]。 3.1.3 丙酮(CH3COCH3)。 3.1.4 甲醇(CH3OH)。 3.1.5 正己烷(C6H14)。 3.1.6 乙醇(CH3CH2OH)。 3.1.7 乙醚(CH3OCH3)。 3.1.8 氯仿(CHCl3)。 3.1.9 次氯酸钠(NaClO)。 3.1.10 生理盐水。 3.2 试剂配制 3.2.1 次氯酸钠溶液(5%):称取次氯酸钠50g,用9950mL水溶解,搅拌使次氯酸钠充分溶解。 3.2.2 甲醇溶液(90%):量取100mL甲醇,加入900mL水,混匀。 3.2.3 乙醇溶液(25%):量取250mL甲醇,加入750mL水,混匀。 3.2.4 氯仿-甲醇溶液(3+97):将氯仿与甲醇按体积比为3∶97混合均匀。 3.2.5 1%吐温60-生理盐水:用生理盐水将吐温60稀释为吐温60含量为1%的溶液。GB5009.274—2016 2 3.3 标准品 太平洋西加毒素-1(P-CTX-1,C60H88O19):纯度≥90%。 3.4 材料 小鼠:昆明系封闭群清洁级(CL)或无特定病原菌级(SPF),且体重为18g~22g的健康雄性小鼠。 4 仪器和设备 4.1 电子天平:感量为0.001g。 4.2 均质器。 4.3 恒温水浴箱。 4.4 旋转蒸发仪。 4.5 氮气浓缩仪。 5 分析步骤 5.1 试样制备 水产品取其可食部分(去骨),切成小块,制成肉糜。于-18℃以下保存。 5.2 试样提取 取试样200g置于塑料袋内,于70℃水浴15min。取出冷却后,加丙酮400mL,均质10min,用布 氏漏斗抽滤并收集滤液。肉渣再重复萃取两次。合并滤液,于55℃旋转蒸发浓缩至近干。加入 100mL甲醇溶液(90%)溶解,转移至500mL分液漏斗中,再加入100mL正己烷,充分振荡萃取,静置 约30min以上,待分层完全,弃去上层正己烷层,收集下层甲醇溶液层。再加入100mL正己烷重复萃 取一次。将下层的甲醇溶液于55℃旋转蒸发至干,以100mL乙醇溶液(25%)溶解,并转移至分液漏 斗中,加入100mL乙醚充分振荡萃取,静置10min以上,待分层完全,收集上层乙醚层。下层溶液再 用乙醚萃取两次。合并乙醚萃取液,于40℃旋转蒸发至近干。浓缩物用5mL氯仿-甲醇溶液(3+97) 溶解并转移至刻度试管中,于45℃用氮气浓缩至干,用1%吐温60-生理盐水定容至2mL,充分振荡, 制成均匀西加毒素-1%吐温60-生理盐水混悬液。0.5mL该混悬液相当于50g试样。以此混悬液进行 小鼠实验。 注:为避免毒素的危害,应戴手套进行操作,用过的器材应在次氯酸钠溶液(5%)中浸泡1h以上,以使毒素分解。 5.3 小鼠试验 5.3.1 实验动物的饲养 小鼠在通风、透光、清洁的室内环境饲养,实验期间正常供给标准啮齿类动物食物和饮水。 5.3.2 小鼠试验 将小鼠随机分为试验组、溶剂对照组、空白对照组3组,每组3只小鼠,每只小鼠称重(精确至 0.5g),并记录体重。用染色法(如3%~5%苦味酸溶液或其他染色剂)做好编号。 5.3.2.1 试验组 每只试验组小鼠腹腔注射0.5mL试样提取液。若注射时注射液溢出,须将该只小鼠弃去,并重新