中华人民共和国国家标准 GB5009.224—2016 食品安全国家标准 大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定 2016-08-31发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 国家卫生和计划生育委员会发布GB5009.224—2016 Ⅰ 前 言 本标准代替GB/T21498—2008《大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定》。 本标准与GB/T21498—2008相比,主要变化如下: ———标准名称修改为“食品安全国家标准 大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定”; ———删除了原标准范围中“胰蛋白酶抑制剂活性可以用来表示豆制品的烘烤程度”; ———修改了“原理”; ———修改了“试剂和材料”; ———删除了“采样”; ———修改了“试样制备”; ———删除了“测定次数”; ———修改了“结果计算”; ———修改了“精密度”; ———删除了“检验报告”; ———删除了附录B。GB5009.224—2016 1 食品安全国家标准 大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定 1 范围 本标准规定了大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性(TIA)的测定方法。 本标准适用于大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定。 2 原理 胰蛋白酶可与苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺(L-BAPA)发生反应,生成对硝基苯胺,该物质在 410nm下有特征吸收。大豆制品中的胰蛋白酶抑制剂可抑制此反应,使吸光度值下降,其下降程度与 胰蛋白酶抑制活性成正比。采用分光光度计在410nm处测定该反应前后的吸光度值,可定量分析胰 蛋白酶抑制剂活性。 3 试剂和材料 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的三级水。 3.1 试剂 3.1.1 盐酸(HCl)。 3.1.2 冰乙酸(CH3COOH)。 3.1.3 氢氧化钠(NaOH)。 3.1.4 氯化钙(CaCl2·2H2O)。 3.1.5 胰蛋白酶(Trypsin):-20℃冻藏。 3.1.6 苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺(L-BAPA)。 3.1.7 三羟甲基氨基甲烷[NH2C(CH2OH)3,Tris]。 3.1.8 二甲亚砜(C2H6OS,DMOS)。 3.2 试剂配制 3.2.1 盐酸溶液(6mol/L):取50mL盐酸(3.1.1)加入水中,用水稀释至100mL,混匀。 3.2.2 盐酸溶液(1mol/L):取83mL盐酸(3.1.1)加入水中,用水稀释至1000mL,混匀。 3.2.3 盐酸溶液(0.1mol/L):取8.3mL盐酸(3.1.1)加入水中,用水稀释至1000mL,混匀。 3.2.4 盐酸溶液(0.001mol/L):取1mL1mol/L盐酸溶液加入水中,用水稀释至1000mL,混匀。 3.2.5 乙酸溶液(5.3mol/L):取30mL冰乙酸(3.1.2)加入水中,用水稀释至100mL,混匀。 3.2.6 氢氧化钠溶液(0.01mol/L):称取0.40g氢氧化钠(3.1.3),溶于500mL水中,用水稀释 至1000mL。 3.2.7 氯化钙盐酸溶液:称取0.735g氯化钙(3.1.4)溶解于1L0.001mol/L盐酸溶液中,用1mol/L 盐酸溶液和0.1mol/L盐酸溶液调节pH至3.0±0.1。GB5009.224—2016 2 3.2.8 胰蛋白酶储备液(0.270mg/mL):将胰蛋白酶(3.1.5)放置至室温,称取胰蛋白酶27.0mg于小 烧杯中,用氯化钙盐酸溶液(3.2.7)溶解,转移至100mL容量瓶中,以氯化钙盐酸溶液(3.2.7)定容至刻 度。保存于0℃~4℃冰箱中,最多可使用5d。 3.2.9 胰蛋白酶使用液(0.0135mg/mL):用移液管量取5.0mL胰蛋白酶储备液(3.2.8)于100mL容 量瓶中,用氯化钙盐酸溶液(3.2.7)定容至刻度。 3.2.10 三羟甲基氨基甲烷-氯化钙缓冲液:称取6.05g三羟甲基氨基甲烷(3.1.7)和0.735g氯化钙 (3.1.4)溶于预先加入900mL水的带有刻度的1000mL烧杯中,用1mol/L盐酸溶液和0.1mol/L盐 酸溶液调节pH值至8.2±0.1,加水至1000mL。 3.2.11 L-BAPA溶液:称取60mgL-BAPA(3.1.6)用1mL二甲亚砜(3.1.8)溶解,用三羟甲基氨基甲 烷-氯化钙缓冲溶液(3.2.10)转移至100mL容量瓶中,稀释至刻度。用时现配。 4 仪器和设备 4.1 可见分光光度计。 4.2 分析天平:感量分别为0.01g、0.001g、0.0001g。 4.3 酸度计:精度为0.05。 4.4 离心机:转速≥4000r/min。 4.5 涡旋振荡器。 4.6 恒温水浴锅:精度为±0.1℃。 5 分析步骤 5.1 试样制备 对于粉末状样品,取有代表性的样品至少200g,充分混匀后备用。对于块状或颗粒状样品,取有代 表性的样品至少200g,粉碎至425μm以下,充分混匀备用。粉碎过程中避免样品过热。 5.2 样品提取 称取1g~10g(精确至0.001g)制备好的试样(5.1)于100mL锥形瓶中,加入50mL0.01mol/L 氢氧化钠溶液,摇匀。用1mol/L盐酸溶液和0.1mol/L盐酸溶液调节pH至9.5±0.1,置于0℃~ 4℃冰箱中静置15h~24h。 将样品提取液取出放置至室温,转移至100mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀。经过15min的 沉淀后,根据需要对样品提取液进行稀释。稀释度取决于预期的样品TIA值。将提取液保存于0℃~ 4℃冰箱中,可保存1d。 5.3 样品提取液稀释 参照附录A中表A.1的稀释方案,将样品提取液稀释三个不同稀释浓度,确保在三个抑制百分率 中至少有一个TIA值的测定结果在40%~60%之间。 如果三个测定结果均没有在此范围内,则需要改变稀释度重新测定。 5.4 胰蛋白酶使用液活性测定 依据表1吸取一定量的溶液分别加入至两个10mL离心管中。