ICS 11.220 CCS B 41 团 体 标 准 T/CVMA 125—2023 牦牛球虫病诊断技术 Diagnostic techniques for yak coccidiosis 2023-7-14发布 2023-7-14实施 中国兽医协会 发 布 N-VýQ}S;SOO CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA125—2023 I前  言 本文件按照 GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由四川农业大学动物医学院提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位：四川农业大学。 本文件主要起草人：谢跃、左之才、周璇、古小彬、徐璟、郭红瑞、马晓平。 N-VýQ}S;SOO CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA125—2023 1牦牛球虫病诊断技术 1范围 本文件规定了牦牛球虫病的临床诊断、病原检查、病理检查、综合判定 等诊断技术要求。 本文件适用于牦牛球虫病的诊断。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 NY/T541—2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3术语和定义 下列术语及定 和适用于本文件。 3.1牦牛球虫病 yakcoccidiosis 由球虫寄生于牦牛肠上皮细胞所引起的以出血性肠炎为特征的急性或慢性肠道原虫病。 3.2 邱氏艾美耳球虫 Eimeria zuernii 寄生于牦牛小肠、结肠、盲肠和直肠上皮细胞内的一种 原虫，其卵囊呈短椭圆形或亚球形，无色 ， 无微孔、极粒及外残体，但有斯氏体及内残体 ，可引起以出血性肠炎为特征的急性肠道球 虫病。 注1：邱氏艾美耳球虫是牦牛球虫病致病力最强的病原种类之一。 注2：邱氏艾美耳球虫卵囊形态见附录 A中A.2和图A.1~图A.2。 3.3 牛艾美耳球虫 Eimeriabovis 寄生于牦牛小肠至直肠上皮细胞内的 一种原虫，其卵囊呈卵圆形 ，淡黄褐色 ，有微孔，无外残体和 极粒，但有斯氏体及内残体 ，可引起牦牛急性出血性肠炎 。 注1：牛艾美耳球虫是牦牛球虫病致病力最强的病原种类之一。 注2：牛艾美耳球虫卵囊形态见A.3 和图A.3~图A.4。 3.4 柱状艾美耳球虫 Eimeriacylindrica N-VýQ}S;SOO CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA125—2023 2寄生于牦牛小肠 和大肠上皮细胞内的 一种原虫，其卵囊呈圆柱状 ，有卵模孔 、内残体和斯氏体 ，无 极粒和外残体 ，可引起慢性出血性肠炎。 注1：柱状艾美耳球虫是牦牛球虫病主要的病原种类之一。 注2：柱状艾美耳球虫的卵囊形态见A.4 和图A.5~图A.6。 3.5 椭圆艾美耳球虫 Eimeriaellipsoidallis 寄生于牦牛肠上皮细胞内的 一种原虫，其卵囊呈卵圆形 ，有内残体和斯氏体 ，无卵模孔 、极粒和外 残体，可引起慢性出血性肠炎 。 注1：椭圆艾美耳球虫是牦牛球虫病主要的病原种类之一。 注2：椭圆艾美耳球虫的卵囊形态见A.5 和图A.7~图A.8。 3.6 阿拉巴艾美耳球虫 Eimeriaalabamensis 寄生于牦牛肠上皮细胞内的 一种原虫，卵囊呈卵形 、梨形或不规则形 ，有斯氏体 ，无卵模孔 、极粒、 内残体和外残体 ，可引起慢性出血性肠炎 。 注1：阿拉巴艾美耳球虫是牦牛球虫病主要的病原种类之一。 注2：阿拉巴艾美耳球虫的卵囊形态见 A.6和图A.9~图A.10。 4临床诊断 4.1急性型 急性型多发生于犊牦牛 ，病程初期表现为精神沉郁 ，被毛粗乱 ，食欲下降 ，腹泻。病程后期出现运 动失调，食欲废绝 ，排出带血水样稀便 ，甚至血便 ，具恶臭味 ，可视黏膜贫血 、苍白、身体消瘦 ，最后 因脱水、衰竭而死。 4.2慢性型 慢性型多见于成年牦牛 ，无明显症状 ，主要表现为厌食 ，间歇性下痢 ，逐渐消瘦 ，生产性能下降等 。 有以上临床症状者，可以怀疑为球虫病，确诊需进一步进行病原或病理检查。 5病原检查 5.1材料与试剂 5.1.1试剂 饱和盐水和 2.5%重铬酸钾溶液，配制方法分别见附录 B中B.l和B.2。 5.1.2器材 样品保存袋 、记号笔、防水标签纸 、孔径为0.25mm（60目）铜丝网或尼龙网 、孔径为0.15mm（100 目）铜丝网或尼龙网、 100mL量筒、50mL烧杯、50mL离心管、10mL离心管、吸管、镊子、天平、离 心机、麦克马斯特计数板、载玻片、盖玻片、显微镜等。 N-VýQ}S;SOO CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA125—2023 35.2样品采集、保存和运输 5.2.1粪便的采集 若是群体采样，采集 牦牛新鲜粪便 ：成年牛群不少于 300g，幼年（3岁以内）牛群不少于 100g；若 是个体采样， 牦牛个体 数应在20头及以上，采集 量成年牛不少于 100g，幼年牛不少于 50g。 5.2.2样品的保存 样品采集后置于样品保存袋中 ，封口后，每份样品的包装袋上均要贴上标签 ，写明采集地点 、采集 时间、牦牛种类、年龄、粪便性状等详细资料，置于 2°C~8°C冰箱内保存。 5.2.3样品的运输 以最快最直接的途径，将所采集的样品送往实验室进行检测，运输条件应符合 NY/T541—2016。 5.3操作 5.3.1定性检查 5.3.1.1 取新鲜粪便 5g~10g，放入50mL烧杯，加入适量自来水。 5.3.1.2 轻轻搅匀，依次经 孔径为0.25mm和0.15mm铜丝网或尼龙网过滤。 5.3.1.3 将滤液转移至 50mL试管，600g（2500r/min）离心10min。 5.3.1.4 倾去上清液，沉淀物中加入少量饱和盐水，混匀，将管内混悬液转移至 10mL离心管内。 5.3.1.5 室温（25°C）用饱和盐水加满离心管，盖上盖玻片（盖玻片应与液面接触），静置 10min。 5.3.1.6 取下盖玻片 ，将有液体的一面盖在载玻片上 ，将载玻片置于显微镜 载物台上，用10×10或10×40 倍数进行镜检 。 5.3.1.7 定性检查的判定标准如下。 a）发现球虫卵囊 ，判为阳性 ，说明该牦牛 （群）已感染球虫 。将球虫阳性粪样置于 2.5%重铬酸钾 溶液，在 25°C~28°C环境培养至孢子化卵囊，见附录 A球虫卵囊形态特征，确定球虫种类； b）未发现球虫卵囊 ，需从5.3.1.1开始，重复检查 5次，仍未见球虫卵囊 ，该粪样可判为阴性 。同 时还需连续采集粪便 14d~21d，每天检查均未发现球虫卵囊，说明该牦牛（ 群）未感染球虫。 5.3.2定量检查 5.3.2.1 对定性检查中呈阳性的粪样，需进行定量检查。 5.3.2.2 将粪便充分混匀，每份粪样取 3个重复。每个重复取 10g放入50mL烧杯，加 入适量自来水 搅匀，先经 孔径为0.25mm铜丝网或尼龙网过滤，用少量自来水冲洗 3~5次滤网，再经 孔径为0.15mm 铜丝网或尼龙网过滤，用少量自来水冲洗 3~5次滤网。 5.3.2.3 将滤液移入 50mL试管，600g（2500r/min）离心10min，弃去上清液，沉淀用少量饱和盐水 搅拌均匀，移入 100mL量筒，加饱和盐水至 60mL处，充分混匀。 5.3.2.4 用吸管吸取混悬液注满麦克马斯特计数板的 2个计数室，静置 5min。 5.3.2.5 将麦克马斯特计数板置于显微镜下，用 10×10倍数计数每个计数室（ lcm×1cm×0.15cm= 0.15cm3）内的所有卵囊数 ，将两个计数室的卵囊数之和除以 2，即为卵囊平均值 。计数过程中对于压线 的卵囊，按左、上压线计 ，右、下压线不计处理 。根据每次重复的卵囊平均值 ，计算出三个重复的平均 值A。 5.3.2.6 每克粪便卵囊数（ oocystpergram，OPG）按照公式（ 1）计算OPG。 OPG＝（A÷0.15）×60÷10＝A×40……………………………… （1） N-VýQ}S;SOO CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA125—2023 4式中： A——5.3.2.5中计算所得 的平均卵囊 数。 5.3.2.7 对卵囊数较多的粪样，可在 60mL总体积的基础上，用饱和盐水再稀释 B倍后计数，按照公 式（2）计算OPG。 OPG＝A×40×B………………………………………… （2） 式中： A——5.3.2.5中计算所得 的平均卵囊 数； B——饱和盐水稀释倍数。 5.3.2.8 定量检查的判定标准如下： a）OPG>10×104，为严重感染； b）1×104≤OPG≤10×104，为中度感染； c）OPG<1×104，为轻度感染。 6病理检查 6.1材料准备 6.1.1磷酸盐缓冲液 （PBS），配制方法见 B.3。 6.1.2恒温箱（4°C~60°C）、显微镜 （100×）、酒精灯、凸刃小刀、棉拭子、自封袋、平皿等。 6.1.3疑为发生球虫感染致死或将要死亡的 牦牛。 6.2病变检查 6.2.1对疑似球虫感染致死或将要死亡的牦牛进行解剖，观察肠道病变情况。 6.2.2发现肠道明显肿大、胀气或变形，肠浆膜面出现针尖大小、颜色为鲜红色、褐色或白色的斑点 或斑块或结节