ICS 65.020.30 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T204432006 鸡组织中已烯雌酚残留的测定 高效液相色谱-电化学检测器法 Method for the determination of diethylstilbestrol in chicken tissue- High performance liquid chromatography with electrochemical detection 2006-08-28发布 2006-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20443—2006 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。 本标准起草单位：农业部畜禽产品质量监督检验测试中心。 本标准主要起草人：杨清峰、吴银良、薛毅、单吉浩、李卫东、王海、刘勇军。 GB/T20443—2006 鸡组织中已烯雌酚残留的测定 高效液相色谱-电化学检测器法 1范围 本标准规定了鸡组织中已烯雌酚残留量测定的高效液相色谱-电化学检测器方法。 本标准适用于鸡组织中（鸡肌肉和鸡肝脏）已烯雌酚残留量的测定。 2原理 鸡组织中的已烯雌酚经叔丁基甲基醚提取、C.柱净化，甲醇和水的混合液洗脱。以甲醇-磷酸盐缓 冲液（pH3.5）为流动相，用高效液相色谱-电化学检测器法测定，外标法定量。电化学检测器对可氧化 还原的化合物具有很高的灵敏度，利用这一特点，可测出痕量的已烯雌酚。 3试剂和材料 所有试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。 3.1叔丁基甲基醚：色谱纯 3.2甲醇：色谱纯。 3.3氢氧化钠溶液：1moL/L水溶液。 3.4乙酸。 3.5乙酸溶液：体积分数为20%水溶液。 3.6磷酸盐缓冲液：0.05moL/L磷酸二氢钾水溶液，pH3.5。 3.7已烯雌酚标准品：纯度99%。 3.8已烯雌酚标准储备液：准确称取一定量的己烯雌酚标准品于棕色容量瓶中，用甲醇溶解后定容至 刻度，得100μg/mL的标准储备液。储存于4℃冰箱中，使用前恢复至室温。 3.9已烯雌酚标准工作液：用前将储备液用甲醇稀释为50ng/mL~2000ng/mL的浓度系列。 4仪器和设备 4.1 高效液相色谱仪，配电化学检测器。 4.2均质器。 4.3固相萃取装置。 4.4 固相萃取小柱：Ci柱，容积为6mL。 4.5 旋转蒸发仪。 4.6心形瓶：100mL。 4.7 分液漏斗：100mL。 4.8酸度计。 4.9涡旋混均器。 4. 10 真空泵 4.11样品浓缩仪。 5样品处理 样品采集后于10000r/min下匀浆（或者将样品尽量粉碎），于一20℃以下冷冻保存，分析用时将其 GB/T20443—2006 解冻后使用。 6分析步骤 6.1提取 称取试样10g（精确至0.01g）于50mL带盖离心管中，加人15mL叔丁基甲基醚，用均质器以 10000r/min的速度均质15s后以3000r/min的速度离心10min，收集上清液，再用15mL叔丁基甲 基醚提取一次，合并有机相至100mL分液漏斗中，加入1moL/L的氢氧化钠溶液10mL，剧烈振摇 1min，静置分层30min，收集水相并用体积分数为20%的乙酸调pH至4.5，备用。 6.2净化 依次用5mL甲醇5mL水和5mL的甲醇：水[V（甲醇）+V（水）=45十55]预洗Cis小柱，然后将 蒸发仪浓缩至约1mL后用甲醇转移至2.0mL的小瓶中，用氮气吹干，最后用300μL流动相溶解供高 效液相色谱-电化学检测器测定用。 6.3测定 6.3.1高效液相色谱条件 色谱柱：Cis3.9mmX150mm; 流动相：甲醇-0.05moL/L磷酸盐缓冲液（pH3.5)[V（甲醇）+V（0.05mol/L磷酸盐缓冲液）= 60+40]; 流速：1.0mL/min; 电化学检测器的灵敏度设在1nA，工作电势为900mV； 进样量：40μL 6.3.2高效液相色谱测定 根据样液中已烯雌酚残留量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中已烯 雌酚响应值均应在仪器检测线性范围内。标准工作溶液和样液等体积参插进样进行测定。在上述色谱 条件下，已烯雌酚保留时间约为7.2min。标准品色谱图参见附录A中图A.1。 6.3.3空白试验 除不加试样外，采用6.1～6.3.2的测定步骤进行平行操作。 6.3.4结果计算和表述 用色谱数据处理系统或按式（1)计算试样中已烯雌酚残留量： As:m X1 000 式中： X——试样中已烯雌酚残留量，单位为微克每千克（ug/kg）； A—样液中已烯雌酚峰面积； As——标准工作液中已烯雌酚峰面积； c———标准工作液中己烯雌酚的质量浓度，单位为微克每升（μg/L）； V——样液最终定容体积，单位为毫升（mL)； m——最终样液所相当的试样质量，单位为克（g)。 7检测限、回收率 7. 1 检测限 7.2回收率 本方法在1ug/kg~100μg/kg添加浓度的回收率为60%~110%。 2 GB/T20443—2006 附录A （资料性附录） 标准品色谱图 已烯雌酚标准品的液相色谱图见图A.1。 40. 00 mV 35. 00 30. 00 25. 01 20. 00 15. 00 DES 10. 0n 5. 00 ↓ 0. 00 5. 00 nin 2. 00 4.00 6. 00 00 '8 10. 00 12. 00 图 A.1 已烯雌酚标准品的液相色谱图