ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T27535—2011 猪流感HI抗体检测方法 Detection method of hemagglutination inhibition antibody against swine influenza 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27535—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 本标准主要起草人：乔传玲、杨焕良、陈艳、辛晓光、陈化兰 1 GB/T27535—2011 猪流感HI抗体检测方法 1范围 本标准规定了猪流感病毒血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验的技术要求 本标准适用于猪流感血清HI抗体的检测。 2仪器 水浴箱、4℃冰箱等。 3 试验材料 单道及多道微量移液器、吸头。 4试剂 4.10.01mol/LpH7.2PBS(参见附录A中A,1)。 4. 2 胰酶溶液（参见附录A中A.2)。 4.3 0.01mol/LKIO,溶液（参见附录A中A.3）。 4. 4 1%丙三醇盐水（参见附录A中A.4)。 4.5 阿氏（Alsevers）液（参见附录A中A.5）。 4.6 0.5%鸡红细胞悬液（参见附录A中A.6）。 4.7 HI试验抗原和阴、阳性血清（参见附录A中A.7)。 5 血凝(HA)试验 5.1 用多道微量移液器在微量反应板的1~12孔均加入0.05mLPBS，换吸头 5.2 吸取0.05mL抗原，加人第1孔，反复抽打3~5次混匀。 5.3从第1孔吸取0.05mL抗原加人第2孔，混匀后吸取0.05mL加人第3孔，如此进行对倍稀释至 第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换吸头。第12孔作为红细胞对照。 5.4每孔均加人0.05mL0.5%（体积分数）鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加人）。 对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果。 5.6结果判定：将反应板倾斜45°，观察红细胞若没有呈泪滴状流尚，则判为HA阳性；完全血凝（不流 消）的病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位（HAU)。 血凝抑制(HI)试验 6 6.1操作步骤 6.1.1血清样品的处理：待检血清样品需经“胰酶-加热-高碘酸盐方法”处理，以去除血清中非特异性 1 GB/T27535—2011 凝集抑制因子。其步骤为：先加0.15mL胰酶溶液于0.3mL血清中，在56℃水浴灭活30min后冷却 至室温；加0.9mL高碘酸钾，混合，室温孵育15min；加0.9mL丙三醇盐溶液，混合，室温孵育15min；加 0.75mL生理盐水并混合，置4℃保存备用。 6.1.2根据HA试验中测定的HI抗原效价配制4HAU的抗原。HA效价除以4即为含4HAU抗原 的稀释倍数。例如，HA效价256，则4HAU抗原的稀释倍数应是64（256除以4）。 6.1.3在微量反应板的2~11孔加入0.025mLPBS,第12孔加入0.05mLPBS。 6.1.4吸取0.05mL血清（待检血清、阳性血清及阴性血清）加人第1孔内，从中吸取0.025mL于第 2孔，充分混匀后吸0.025mL于第3孔，依次对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃去。 6.1.51～11孔均加入含4HAU混匀的抗原0.025mL，第12孔作为红细胞对照。室温（20℃～25℃） 下静置10min~30min。 6.1.6每孔加人0.05mL0.5%（体积分数）的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，室温（20℃～25℃）下静 判定结果。 6.2结果判定 6.2.1检测结果成立的条件：已知阳性血清与相应抗原反应后出现预期的HI效价，阴性血清与抗原 反应HI结果为阴性；反之试验重新进行。 6.2.2以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI效价。待检猪血清经过处理后已作 6.2.3未经疫苗免疫的猪只经过14d后再次采样，测定，如果第二次的抗体高于第一次2个滴度，判 为该猪处于感染期。 7注意事项 7.1标准抗原稀释液浓度为4个HAU,并且在每次试验前进行标定。 中解脱，如果有这种情况的发生，要提前判定或置4℃下孵育。 7.3红细胞悬液始终符合标准。 7.4反应试剂要按规定保存和使用。为避免反复冻融和细菌污染，应以无菌操作将试剂分装成小 包装。 7.5冻干的试剂应按照说明书中规定的体积重新溶解并保存。 N GB/T 27535—2011 附录 A （资料性附录） 相关试剂的配制 A. 1 0. 01 mol/L pH 值 7. 2 PBS NaCl 8g KCI 0.2 g Naz HPO4 1.42 g 0.27 g KH,PO4 灭菌双蒸水 800 mL NaOH或者HCl调pH(7.0～7.4），灭菌双蒸水加至1000mL定容，121℃高压灭菌15min或过 滤除菌。 A.2 2胰酶溶液 200 mg 胰酶（P-250) 0. 01 mol/L PBS 加至25mL 过滤除菌，分装保存于一20℃或一70℃，每6个月重新配制胰酶。 A.3 0.01mol/LKI04溶液 KIO4 230mg 0. 01 mol/L PBS 加至100mL 过滤除菌，KIO,溶液新鲜配制，在1周内使用。 A. 4 1%丙三醇盐水 丙三醇 1 mL 0.01 mol/L PBS 99 mL 过滤除菌。 A.5 阿氏（Alsevers）液 葡萄糖 2. 05 g 0.8g 柠檬酸钠 柠檬酸 0.055 g 氯化钠 0.42 g 灭菌双蒸水 至100 mL NaOH 或者 HCI 调 pH 6. 1 121℃高压灭菌15min，2℃~8℃保存备用。