ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T26436—2010 禽白血病诊断技术 Diagnostic techniques for avian leukosis 2011-01-14发布 2011-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 26436—2010 前言 本标准的附录 A、附录 B、附录 C、附录 D、附录E、附录 F为规范性附录,附录 G、附录H为资料性 附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SC/TC181)归口。 本标准起草单位：山东农业大学、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、华南农业大学。 本标准主要起草人：崔治中、孙淑红、赵鹏、杨素、沙才华、廖明、曹伟胜 I GB/T264362010 引言 禽白血病病毒（avianleukosisviruses；ALV)为反转录病毒科的α反转录病毒属，可诱发鸡不同组 织的良性和恶性肿瘤，是鸡群中除马立克氏病病毒（MDV）和禽网状内皮增生症病毒（REV）外的又 类重要的致肿瘤病毒 禽白血病是一类由ALV相关的反转录病毒引起鸡的不同组织良性和恶性肿瘤病的总称。随发生 肿瘤的主要细胞成分不同，分别称之为不同名称的肿瘤。ALV可分为A～J10个亚群，其中仅A亚 群、B亚群、C亚群、D亚群、E亚群、J亚群病毒与鸡相关。A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、J亚群属外 源性ALV，与离白血病的不同类型肿瘤发病相关。E亚群病毒基因组可完整地整合进感染鸡的染色体 基因组并稳定地遗传下去，也可从中再复制出传染性病毒颗粒，因而称之为内源性病毒。此外，在一些 鸡的染色体的不同部位，还可能带有一些ALV的基因组片段。E亚群ALV的致病性很低或没有致病 性，不属于净化对象，但很多鸡群中包括一些无特定病原（SPF）鸡群都可能带有E亚群内源性ALV，它 的感染不会给鸡群带来不良影响，但会干扰检测。 目前，该病对我国养鸡业的危害很大。在国际种禽贸易中，外源性白血病病毒感染是最主要的检测 对象之一。 GB/T26436—2010 禽白血病诊断技术 1范围 本标准规定了病料中ALV特异血清抗体和外源性ALV的检测方法。 本标准适用于判断鸡群或病料中是否有外源性ALV感染。 SAC 2临床症状和病理变化 ALV主要引起感染鸡在性成熟前后发生肿瘤死亡，感染率和发病死亡率高低不等，死亡率最高可 达20%。一些鸡感染后虽不发生肿瘤，但可造成产蛋性能下降甚至免疫抑制。 淋巴样白血病是最为常见的经典型白血病肿瘤，肿瘤可见于肝、脾、法氏囊、肾、肺、性腺、心、骨髓等 器官组织，肿瘤可表现为较大的结节状（块状或米粒状），或弥漫性分布细小结节。肿瘤结节的大小和数 量差异很大，表面平滑，切开后呈灰白色至奶酪色，但很少有坏死区。在成红细胞性白血病、成髓性细胞 白血病、髓细胞白血病中，多使肝、脾牌、肾呈弥漫性增大。J亚群ALV感染主要诱发髓细胞样肿瘤，它最 常见的特征性变化主要为肝脾肿大或布满无数的针尖、针头大小的白色增生性肿瘤结节。在一些病例 中，还可能在胸骨和肋骨表面出现肿瘤结节 单纯苏木精伊红染色（H.E染色）的病理组织切片观察在诊断上有一定参考意义。在表现为淋巴 样细胞肿瘤结节时，要注意与马立克氏病病毒（MDV）和禽网状内皮增生症病毒（REV)诱发的肿瘤相 区别；在表现为髓样细胞瘤时，既要与REV诱发的类似肿瘤细胞相区别，也要与嗜中性白细胞浸润性 炎症相区别，如鸡戊型肝炎病毒感染引起的肝局部炎症。最终的鉴别诊断以肿瘤组织中的病毒抗原检 测或病毒分离鉴定为最可靠依据。 3病毒的分离培养、检测和鉴定 3.1试剂和仪器 3.1.1试剂 DMEM液体培养基（pH7.2）、0.25%胰酶、磷酸盐缓冲液（0.01mol/LPBS.pH7.2）、抽提缓冲液、 （FITC)标记的山羊抗小鼠IgG抗体、ALV-p27抗原酶联免疫吸附试验（ELISA)检测试剂盒、聚合酶链 反应（PCR）试剂、RT-PCR试剂、生理盐水（0.9%氯化钠）、无水乙醇（分析纯）、丙酮（分析纯）、甘油（分 析纯）、75%酒精、碘酒、细胞生长液（含有5%胎牛血清或小牛血清的DMEM液体培养基）、细胞维持液 钠（分析纯）、三氯甲烷（分析纯）、异戊醇（分析纯）、异丙醇（分析纯）、10X加样缓冲液、琼脂糖、DL2000 DNAMarker、TAE电泳缓冲液、氯化钙（0.1mol/L）、氨苄青霉素（100μg/μL）、双蒸水、LB液体培养 基、TE缓冲液、RNase、细胞裂解液、0.1%的DEPC（焦碳酸乙二酯）水等（除特殊说明外，上述试剂均为 分析纯）。 3.1.2仪器 锥形瓶、荧光显微镜、恒温培养箱，冰冻台式离心机（≥12000r/min）、一20℃冰箱、一80℃冰箱、 1 GB/T26436—2010 Eppendorf管（离心管）、棉棒、载玻片、盖玻片、细胞培养平皿、37℃数显恒温水浴锅、37℃摇床、96孔 培养板、SPF隔离器、紫外光凝胶成像分析仪、微量移液器、低温恒温水槽（16℃）、吸水纸 3.2分离病毒用细胞 3.2.1鸡胚成纤维细胞(CEF) 鸡胚成纤维细胞制备方法见附录A。 3.2.2鸡胚成纤维细胞自发永生株（DF1)细胞 DF1细胞培养基制备方法见附录B。 3.3病料的采集与处理 3.3.1全血、血清或血浆 取疑似病鸡的全血、带有白血细胞的血浆或血清，无菌接种于长成单层的CEF或DF1,置于含5% 二氧化碳的37℃恒温培养箱中培养。 3.3.2脏器 采集疑似病鸡的脾脏、肝脏、肾脏，按脏器质量的1倍～2倍加人灭菌生理盐水（含青霉素和链霉素 各1000IU/mL)研磨，直至成勾浆液。将悬液移至离心管中充分摇振后，4℃，10000r/min离心 5min，收集上清液。按3.4.1.1中的方法接种培养或一70℃保存备用。 3.3.3疫苗样品 疫苗样品处理后接种CEF培养扩增病毒。但为了鉴别是否是外源性ALV，应接种DF1细胞或其 他抗E亚群白血病鸡细胞(C/E)鸡来源的细胞。 3.3.4咽喉、泄殖腔棉拭子 时，将棉拭子深人泄殖腔转3圈并沾取少量粪便；将棉拭子头一并放入盛有1.5mL磷酸盐缓冲液的无 菌离心管中（含青霉素和链霉素各1000IU/mL），盖上管盖并编号，10000r/min离心5min后取上清 备用。 3.4病毒的分离培养与鉴定 3.4.1病毒的分离培养 胞维持液，继续培养5d~7d。 3.4.1.2细胞传代：将3.4.1.1培养的细胞传代于加有盖玻片的平皿中，培养5d～7d。 3.4.2病毒的鉴定 3.4.2.1间接免疫荧光抗体反应（IFA） 3.4.2.1.1固定 将盖玻片上的单层细胞，在自然干燥后滴加丙酮-乙醇（6：4）混合液室温固定5min，待其自然干 2