ICS 07.080 B 30 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 30988—2014 多酚类植物基因组DNA提取纯化 及测试方法 Methods of genomic DNA extraction from plants with high levels of polyphenols 2014-07-24发布 2015-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T30988—2014 目 次 前言 II 范围 规范性引用文件 2 3 缩略语 4 原理 实验室通用要求 5 试剂与溶液 6 仪器和设备 提取步骤 8 DNA纯度、浓度测试 9 GB/T30988—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中国测试技术研究院提出。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）归口。 本标准起草单位：中国测试技术研究院、中测测试科技有限公司。 本标准主要起草人：谭和平、沈兴中、唐祥凯、周李华、孙登峰。 GB/T30988—2014 多酚类植物基因组DNA提取纯化 及测试方法 1范围 本标准规定了以茶树为代表的多酚类植物基因组DNA提取纯化方法以及DNA纯度、浓度测试 方法。 本标准适用于茶树、马铃薯、樱桃、葡萄以及其他富含多酚类的植物的植物基因组DNA提取及 纯化。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682—2008分析实验室用水规格和实验方法 GB/T19495.3—2004转基因产品检测核酸提取纯化方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Tris：三（羟甲基）氨基甲烷 SDS：十二烷基磺酸钠 PVP：聚乙烯吡咯烷酮 RNaseA:核糖核酸酶A FF：二甲苯青 EDTA：乙二胺四乙酸 TE：三（羟甲基）氨基甲烷-乙二胺四乙酸 4原理 4.1提取纯化 在液氮条件中，通过物理研磨方法破碎多酚类植物叶片的细胞，利用抗氧化剂防止多酚类化合物氧 化褐变，同时利用聚乙烯吡咯烷酮（PVP)的粘接性去除多酚类化合物及其他次生代谢物等杂质，然后利 用化学方法使DNA从植物细胞中释放出来，再弃除DNA中的蛋白质等杂质，以及DNA提取过程中 加入的异戊醇、异内醇、乙醇等有机溶剂，最后得到纯的DNA。 4.2 纯度测试 在pH7~8.5下，根据DNA在260nm处有吸收高峰，蛋白质在280nm处有吸收高峰，硫氰酸盐、 碳水化合物（糖类）在230nm处有吸收高峰，酚类物质在270nm处有吸收高峰的特性，利用A260/A280、 1 GB/T30988—2014 A260/A230A260/A270的比值来评估DNA样品的纯度。然后利用A260=1相当于50g/mL的双链 DNA来计算DNA的浓度。 利用荧光染料（如溴化乙啶）可与琼脂糖凝胶中的DNA嵌合，在紫外源激发下发出荧光的特性，通 过观察DNA条带是否单一、清晰、明亮来评估DNA样品的纯度。 5实验室通用要求 按照GB/T19495.3一2004第4章中实验室通用要求的规定执行。 6试剂与溶液 6.1本标准所使用的水均为一级水，符合GB/T6682一2008的要求。除非另有说明，在分析中仅使用 分析纯试剂，所有试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后经高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂应用 0.22μm膜过滤除菌；酶溶液应避免反复冻融。 6.2# 葡萄糖（glucoseC,HizO,）。 6.3 焦亚硫酸钠（sodiumPyrosulfite，NazS,Os）。 6.4 聚乙烯吡咯烷酮polyvinylpyrrolidone，PVP，（CHNO)，」。 6.5F β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol,HOCH,CH,SH)。 6.6 十二烷基磺酸钠（sodiumdodecyl sulfate,SDS,C2H25O,SN)。 6.7 乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic aciddisodium salt,Na,EDTACiH4N,O.Na2）。 6.8 三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）methylaminomethane，Tris，C,HNO：」。 6.9 无水乙醇（alcohol,C,H，OH），4℃保存及使用。 6.10 氯化钠（sodiumchloride，NaCl）。 6.11 三氯甲烷（chloroform，CHCl）。 6.12 异丙醇[isopropyl alcohol,CH.CH(OH)CH,]。 6.13 异戊醇[isoamyl alcohol,(CH,)CHCH,CHOH 6.14乙酸钠（sodiumacetate,NaAc)溶液：3mol/L,用乙酸调pH至5.2,不要高压灭菌（0.22μm膜过 滤)。 6.15 氯仿：异戊醇：乙醇溶液（80：4：16）。 6.16 DNA提取液I:100mmol/LTris-Cl,20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS。 6.17 DNA提取液I：18.6g葡萄糖，6.9gNazSzO5，6.0gPVP,240μLβ-硫基乙醇，加水至300mL。 6.18 TE缓冲液(pH8.0):10 mmol/LTris-Cl,1 mmol/LEDTA,使用HCI或NaOH调节pH。 6.19 RNaseA酶溶液：10mg/mL，一20℃保存，避免反复冻融。 6.20 70%乙醇溶液：4℃保存及使用。 6.21 10×上样缓冲液：含0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油水溶液。 7仪器和设备 7.17 冷冻研磨机（样品冷冻，研磨都处于液氮条件下）。 7.2离心机（可以在4℃下进行离心，离心转速10000r/min以上）。 7.3 水浴锅（工作范围60℃～70℃）。 7.4 涡旋器。 7.5 平板电泳仪。 2