ICS 65.120 B 46 GD 中华人民共和国国家标准 GB/T30955—2014 饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 Determination of aflatoxin B, ,B2,G,G2 content in feeds- High performance liquid chromatography with immunoaffinity column clean-up 2014-07-08发布 2015-01-10实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T30955—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）归口。 本标准起草单位：浙江大学饲料科学研究所、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国 家饲料质量监督检验中心（北京）、北京中检维康技术有限公司。 本标准主要起草人：余东游、饶正华、李卫芬、李兰、王雄、果旗、梁权 GB/T30955—2014 饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 1范围 本标准规定了饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的免疫亲和层析净化-高效液相色谱法的测定 方法。 本标准适用于饲料中黄曲霉毒素B、B2、Gi、G2的测定。 本标准的检测限：黄曲霉毒素Bi为0.2μg/kg，黄曲霉毒素Bz为0.2μg/kg，黄曲霉毒素Gi为 0.3μg/kg，黄曲霉毒素G2为0.3μg/kg。 本标准的定量限：黄曲霉毒素B为1.0μg/kg，黄曲霉毒素Bz为1.0μg/kg，黄曲霉毒素G为 1.0μg/kg，黄曲霉毒素Gz为1.0μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3原理 试样经过甲醇-水提取后，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层 析柱层析净化，经高效液相色谱仪分离，荧光检测器柱后光化学衍生测定黄曲霉毒素BI、B2、GI、G2的 含量。 4试剂 除非另有说明，均为分析纯的试剂；实验室用水符合GB/T6682中二级用水规定，标准溶液和流动 相用水符合一级用水规定。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2苯：色谱纯。 4.3乙腈：色谱纯。 4.4甲醇十水（8十2）：取80mL甲醇（4.1)加20mL水，混合均勾。 4.5 甲醇十水（45+55）：取45mL甲醇（4.1）加55mL水，混合均勾。 4.6苯十乙腈（98十2）：取2mL乙腈（4.3）加人98mL苯（4.2），混合均匀。 4.7黄曲霉毒素标准储备溶液：用苯十乙腈（98+2）溶液（4.6）分别配制0.100mg/mL的黄曲霉毒素 BI、B2、G1、G2标准储备液，保存于4℃备用，可使用1年。 4.8 3黄曲霉毒素混合标准工作液：准确移取适量的黄曲霉毒素B、B2，Gi、G2标准储备溶液（4.7） 1 GB/T309552014 50℃下，氮气吹干仪吹干，用适量的甲醇十水（45十55）溶液（4.5）定容为混合标准工作液，黄曲霉毒素 B,、Bz、G、G2各分别为0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL。 4.9PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL 纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0,最后用纯水稀释至1000mL 4.10次氯酸钠。 5仪器和设备 实验室常规仪器、设备、材料及下列各项。 5.17 高速均质器，18000r/min～22000r/min，或震荡器。 5.2# 黄曲霉毒素免疫亲和柱，柱容量≥300ng。 5.3 玻璃纤维滤纸，直径11cm，孔径1.5μm。 5.4 玻璃定量管，10mL。 5.5 氮吹仪，50℃。 5.6 光化学衍生系统。 5.7 高效液相色谱仪，带荧光检测器 6 试样采集与制备 按GB/T14699.1采样；按GB/T20195用四分法缩减至500g，粉碎后过1mm孔径的分析筛，混 匀后装人密闭容器，冷藏保存。 7分析步骤 7.1提取 称取试样（粒度小于1mm）50.0g于250mL具塞锥形瓶中，加人5.0g氯化钠及准确加人100.0ml (V.）甲醇十水（8十2）溶液（4.4），以均质器高速搅拌提取2min，或震荡器震荡30min。定量滤纸过滤， 滤液澄清，备用。 7.2净化 将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃定量管下。准确移取10.0mL（V.）样品提取液注人玻璃定量管 中，将空气压力泵与玻璃定量管连接，调节压力使溶液以不超过2mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱， 待溶液全部流出后，以10.0mL纯水清洗柱子2次，弃去全部流出液。准确加人1.0mL（V）甲醇（4.1） 洗脱，流速不超过1mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，加纯水定容为2.0mL，供色谱检测用。 7.3测定 7.3.1色谱条件 色谱柱：Cs柱，长150mm，内径4.6mm，填料直径5μm，或相当者。 流动相：甲醇+水（45+55）溶液（4.5）。 流速：0.8mL/min。 检测波长：激发波长360nm；发射波长440nm。 2 GB/T30955—2014 光化学衍生系统。 柱温：30℃。 进样量：20μL。 7.3.2 色谱测定 分别取相同体积样液和标准工作溶液注人高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值 （峰高或峰面积）。经过与黄曲霉毒素BI、B2、Gi、G²标准溶液谱图比较响应值得到试样中黄曲霉毒素 Bi、Bz、Gi、G2的浓度c(μg/L)。标准品色谱图参见附录A。 警告一一黄曲霉毒素是高致癌性物质，应十分小心处理。使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液用 5%浓度次氯酸钠溶液浸泡过夜。 3结果计算与表述 8 8.1 结果计算 试样中黄曲霉毒素B、Bz、Gi、G²含量以质量分数X，计，单位为微克每千克（μg/kg），按式（1) 计算： X103 .(1) Pst Xm XV 式中： P, 试样溶液中黄曲霉毒素BI、Bz、GI、Gz各组分的峰面积值； V. 样品的总稀释体积，单位为毫升（mL）； 黄曲霉毒素Bl、Bz、G、G²各标准溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)； c 标准溶液的进样体积（μuL）； Pst 黄曲霉毒素Bi、Bz、Gi、G2各标准溶液峰面积平均值； 试样质量，单位为克（g）。 m 8.2 2结果表示 测定结果用平行测定的算术平均值表示，计算结果表示到小数点后一位 重复性 9 在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于其算术平均值的15%。 SAG