ICS 71.100.70 C2682 Y42 上海日用 化学品行业协会 团体标准 T/SHRH 00 7-2018 _________________________________________________________________________________________ 化妆品 -体外皮肤刺激性测试方法 （ET-50） Cosmetics -In Vitro Skin Irritation Test Method （ET-50） 2018-12-01发布 2018-12-30实施 上海日用化学品行业协会 发布 1 目 次 前言…………………………………………………………………………… ……………… 2 1.范围…………………………………………………………………………… …………… 3 2.参考资料 ……………………………………………………………… …………… ……… 3 3. 术语、定义和缩略语 ………………………………………………… …………………… 3 4.试验方法…………………………………………………………… ………………… …… 4 5 试验结果 ……………………………………………… ………… ………………………… 7 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准起草单位： 广东博溪生物科技有限公 司、上海家化联合股份有限公司、 伽蓝（集团）股份有 限公司、上海相宜本草化妆品股份有限公司 、上海中翊日化有限公司 、上海市质量监督检验技术研究院、 玫琳凯（中国） 有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海清轩生物科技有限公司 、汉高（中国） 投资有限公司、东阿阿胶股份有限公司 、上海日用化学品行业协会 。 本标准主要起草人： 卢永波、李潇、李润芝 、陈田、吴建铭、吕智、 孙培文、 林艺青、 戴彦韵、万 向红、李琼、高宏旗 、金坚、陈亦华 3 化妆品 -体外皮肤刺激性测试方法 （ET-50） 1 范围 本标准规定了皮肤模型对 体外皮肤刺激性试验的术 语和定义、试验方法和试验结果。 本标准适用于对化妆品、化学品进行皮肤刺激性的测定 。 2 参考资料 本方法参考 《In Vitro safety testing for skin irritation using the 3D reconstructed human epidemis 》制 定。 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语、定义 3.1.1 皮肤刺激性 skin irritation 皮肤涂覆受试样品后局部产生的可逆性炎性变化 。 3.1.2 细胞活力 cell viability 测量细胞群总活性的参数 ，例如细胞线粒体脱氢酶对活性染料 MTT的还原能力， 这主要与活细胞 的总数和 /或活力相关。 3.1.3 半数有效时间 median effective time 固定浓度下施用 受试样品 后将细胞存活率降低 50％所需的暴露时间。 3.2缩略语 3.2.1 ET50 –median effective time （半数有效时间） 3.2.2 MTT –3-(4,5-dimethyl -2-thiazolyl) -2，5-diphenyl -2H-tetrazolium bromide [3-（4,5 -二甲基 - 2 -噻唑） -2,5二苯基 -2氢-四氮唑溴盐 ] 3.2.3 OD - Optical Density (吸光度 ) 3.2.4 PBS – phosphate buffered saline （磷酸盐缓冲液） 4 4 试验方法 4.1试验材料 4.1.1体外重组 3D表皮模型检测试剂盒： 表1 体外重组 3D表皮模型检测试剂盒内容物 内容物 规格 保存条件 /时间 体外重组 3D表皮模型 :EpiKutis® 24个模型 /孔板 4℃, 3d EpiRecovery 培养液 按每个模型使用 5mL计算 4℃, 14d 4.1.2试验材料 表2 试验试剂详细信息 试剂名称 生厂商 /货号 保存条件 /时间 PBS 博士德 /PYG14190 4℃, 6个月 Triton X -100 SIGMA/ T 8787 室温 , 2年 MTT SIGMA/V900888 -20℃, 1个月 异丙醇 国药集团化学试剂有限公司 /90109218 室温 , 2年 4.1.3试验耗材与设备 表3 试验耗材和设备及用途说明 耗材或仪器名称 用途说明 无菌 24孔板 用于 MTT孵育和浸提 无菌 6孔板 用于培养 3D表皮模型 无菌 96孔板 用于读取浸提液体吸光度 超净工作台 提供百级洁净工作环境 CO 2培养箱 用于培养 3D表皮模型 孔板振摇器 辅助溶解甲瓒结晶 计时器 控制试验中的操作时间 无菌镊子 夹取 3D表皮模型 5 表3（续） 试验耗材和设备及用途说明 无菌止血钳 在清洗过程中，夹取 3D表皮模型 无菌尼龙膜 辅助液体受试物在模型表面的铺展 500 mL塑料清洗瓶 用于盛装 PBS，清洗 3D表皮模型 2000 mL 烧杯 用于 PBS溶液配制 研钵 用于研碎固体样品 正向加液器 吸取凝胶、乳膏、半固体测试物或悬液等 酶标仪 用于读取浸提液体吸光度 封口膜 防止异丙醇挥发 无菌棉签 用于擦拭模型表面液体残留物 吸水纸 用于吸干 3D表皮模型外部的残余液体 4.2 试验步骤 4.2.1 试剂盒接收与检定 收到试剂盒后，打开外包装。肉眼观察模型与固体培养基接触界面是否有气泡。如发现模型接触界 面有明显气泡，应作丢弃处理。 4.2.2 模型复苏 a) 准备充足的无菌 6孔板（按每 3个模型准备一个 6孔板） ，去除 6孔板外包装后，放入超净工作 台内。 在 6孔板每孔中添加 0.9mL EpiRecovery 培养液，将剩余 EpiRec overy培养液放入 4℃冰箱 保存备用。 b) 打开模型内包装袋，观察表面及四周是否有液体渗出或收缩现象，如表面存有大量水分，应 作丢弃处理。 c) 用无菌镊子沿塑料壁上缘夹出模型，并在模型包装孔板中自带的无纺布上轻轻拭去模型底部 的琼脂或其他液体。 d) 在加有 EpiRecovery 培养液的 6孔板的第一排依次放入 3个模型。放入模型时，应适当倾斜模型 底面，使模型与 EpiRecovery 培养液充分接触，防止产生气泡。 e) 将放有模型的 6孔板全部转移至 CO 2培养箱（ 37± 1℃、5± 1%CO 2、95%相对湿度）中，孵育 60± 5min。 f) 培养结束后，用无菌镊子将模型从 6孔板的第一排转移到第二排孔中，再将 6孔板放回到 CO 2 培养箱（ 37± 1℃、5± 1% CO 2、95%相对湿度）中孵育过夜（ 18± 3h）。 4.2.3 测试准备 6 a) 配置 1%（V/V）TritonX -100溶液。使用正压移液器吸取 100μL TritonX -100，加入到 10mL无 菌离心管中，再向离心管中补加 9900μL PBS溶液，吹打溶解后，用 0.22μm 滤器过滤 ，盛装 于10mL无菌离心管中， 4℃冰箱保存 备用。 b) 实验分组包含对照组（ 1%（V/V）TritonX -100）和样品组 。对照组给药时间设定为： 0h（不 给药），2h，4h；驻留型样品给药时间一般设定为： 0h（不给药） ，6h，16h，24h；洗去型样 品给药浓度一般设定 为： 2%，给药时间一般设定为： 0h（不给药） ，6h，16h，24h。 c) 样品组给药时间可参 考样品的其他信息进行微 调。 d) 受试物预处理：在 37℃或低温条件下能够用移液器吸取的受试物以液体受试物对待 。粘稠、 蜡状、树脂状、凝胶状等受试物在 37± 1℃条件下孵育 15± 1min，若处理后能够用移液器吸取 则以液体受试物对待，若不能则以固体受试物对待 。粉末状、颗粒状等受试物以固体受试 物 对待。 e) 给对照组各时间点 准备一个新的 6孔板，标记与 对照组各时间点 对应，并在 6孔板第一排孔中 添加 0.9 mL的EpiRecovery 培养液。为 样品组各时间点 准备新的 6孔板，同一检测时间点的两 种不同受试样品可合用一个 6孔板，标记与实验分组 &时间点对应，并在 6孔板各孔 中添加 0.9 mL的EpiRecovery 培养液。其中，各样品组 0h时间点可采用对照组 0h时间点数据，不予重复 准备模型。 f) 将复苏结束 后的模型转移至标记后的 6孔板中，每种受试物 &时间点对应 3个模型重复。 4.2.4受试物给药（在超净工作台中进行以下操 作） a) 对模型进行受试物给药操作 。每