ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31810—2015 玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofMaizechloroticmottlevirus 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验 检疫局。 本标准主要起草人:张卫东、张永江、张慧丽、王岚、杨翠云、廖力、李旻、迟远丽、徐淼锋、权永兵、 闻伟刚、陈其文。 ⅠGB/T31810—2015 玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定的方法。 本标准适用于可能携带玉米褪绿斑驳病毒的种子、种苗等植物繁殖材料中玉米褪绿斑驳病毒的检 疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2964—2011 植物病毒检测规范 3 仪器设备、设施和主要试剂 3.1 仪器设备 酶标仪、洗板机、普通PCR仪、荧光PCR仪、微量分光光度仪、生物安全柜、高压灭菌锅、培养箱、微 量天平(感量:0.001g)、冰箱、离心机、酸度计、水浴锅、电泳仪、凝胶成像系统、移液器(1000μL、 200μL、100μL、10μL、2.5μL)。 3.2 设施 隔离温室(10℃~30℃)。 3.3 主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯。主要试剂和缓冲液见附录B中B.1和附录C中C.1。 4 抽样和检测样品的制备 4.1 抽样 抽样按照SN/T2122的规定执行。 4.2 检测样品的制备 4.2.1 种子类 挑取至少500粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)样品,经3%次氯酸钠(NaClO)表面消毒 10min后,将种子置于灭过菌的土壤中,在适宜的发芽温度(25℃~28℃)条件下催芽,直至长出3片~ 4片真叶进行检测。选取具有褪绿、畸形等症状的植株幼嫩叶片全部进行编号检测,同时随机抽取至少 20株无症状植株样品进行混样检测。 1GB/T31810—2015 4.2.2 种苗类 对于有症状的种苗类样品单独检测,重点选取表现症状种苗类样品的幼嫩叶片;对于无症状的种苗 类样品至少选取20株的幼嫩叶片进行混样检测。 5 检疫鉴定方法 5.1 DAS-ELISA检测 DAS-ELISA检测方案设计参照SN/T2964—2011。在一次血清学检测试验中,设置2个阳性对 照孔、2个阴性对照孔、2个空白对照孔作为质量控制,并根据送检样品数量设置待检测样品孔数,要求 每个待测样品设两次重复。所有点样孔都安排在酶联板内部,防止边际效应的发生,影响检验结果的准 确性。 具体操作见附录B。 5.2 RT-PCR检测 RT-PCR检测用健康的植物组织作阴性对照,用感染MCMV的植物组织作阳性对照,用ddH2O 作空白对照,每个反应体系设置两个平行样。 具体操作见附录C。 5.3 实时荧光RT-PCR检测方法 实时荧光RT-PCR检测用健康的植物组织作阴性对照,用感染MCMV的植物组织作阳性对照,用 ddH2O作空白对照,每个反应体系设置两个平行样。 具体操作见附录D。 6 结果判定 样品经DAS-ELISA、普通RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阴性时,判定样品未检出玉米 褪绿斑驳病毒。 样品经DAS-ELISA检测结果为阳性,进一步用RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法进行检测。 PCR结果为阴性,判定未检出玉米褪绿斑驳病毒;PCR结果为阳性,可以判定为样品检出玉米褪绿斑驳 病毒。 7 样品保存和复核 7.1 样品的保存 经检验确定携带MCMV的样品应在合适的条件下保存,种子保存在4℃,其他繁殖材料采病叶经 液氮干燥后在-80℃条件下保存。 7.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员 和审核人员签字。酶联免疫方法应有酶联反应的原始数据,PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片,荧 光PCR检测应附扩增图谱。 2GB/T31810—2015 7.3 结果复核 检验结果的复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责,主要考察实验记录、照片等 资料的完整性和真实性,必要时进行复核实验。 3GB/T31810—2015 附 录 A (资料性附录) 玉米褪绿斑驳病毒相关资料 A.1 背景资料 A.1.1 玉米褪绿斑驳病毒基本信息 学名:Maizechloroticmottlevirus 异名:Maizechloroticmottlemachlomovirus;Maizemottlevirus;Perucornvirus 缩写:MCMV 分类地位:番茄丛矮病毒科(Tombusviridae),玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)。 A.1.2 方法原理 玉米褪绿斑驳病毒的分子生物学特性、血清学特性和生物学特性是本标准制定的主要依据。 A.2 寄主范围 MCMV的自然寄主只有玉米,实验条件下可侵染小麦(Triticumaestivuml)、大麦(Hordeumvul- gare)、燕麦(Avenaludoviciana)、高粱(Sorghumbicolor)等19种禾本科植物。 A.3 分布 MCMV主要分布于阿根廷、墨西哥、秘鲁、美国、泰国等。 A.4 传播方式 MCMV可通过昆虫介体进行自然传播,主要介体包括黑角负泥虫(Oulemamelanopus)、玉米跳甲 (Chaetocnemapulicaria)、十一星黄瓜跳甲(Diabroticaundecimpunctata)、长角黄瓜甲虫(D.longi- cornis)、玉米根萤叶甲(D.virgifera)和威廉期花蓟马(Frankliniellawilliamsi)等,机械接种和嫁接 也能传播,还可以随寄主植物以及通过种子进行远距离传播。 A.5 症状 MCMV自然条件下只能侵染玉米,可引起多种症状,产量损失10%~15%。感染MCMV的玉米 节间距变短矮化,叶片开始出现与叶脉平行褪绿条纹后来接合呈长条形褪绿斑,最后叶片坏死和偏上弯 曲,雄性花序坚硬,短花轴、少数穗并且呈畸形,感染严重的植株可能导致死亡。感染MCMV的植株越 幼嫩,出现的矮化症状越严重。另外,该病毒能与玉米矮花叶病毒(Maizedwarfmosaicvirus)、小麦 条纹花叶病毒(Wheatstreakmosaicvirus)和甘蔗花叶病毒(Sugarcanemosaicvirus)复合侵染,作物 产量损失最高可达91%。 4GB/T31810—2015 A.6 病毒粒体形态 病毒粒子为等轴对称二十面体(T=3),用磷钨酸负染色直径约30nm,用醋酸铀负染直径约为 33nm,无包膜,粒子外形呈六边形,有的被染色剂渗透,有180个蛋白结构亚基。 A.7 核酸 为单分子线形正义ssRNA,长4437nt,核酸占病毒粒子质量的18%。有的病毒粒子还偶尔含有 一个1100nt的亚基因组RNA。 A.8 基因组 单分体基因组,RNA的3'端无Poly(A),5'端有一个序列为m7G5'PPPA的甲基化核苷酸帽子结 构。病毒基因组含有4个ORF,ORF1编码一个32ku蛋白,ORF2编码50ku蛋白,对ORF2琥珀终 止密码子的超读使翻译持续到ORF2RT,产生一个111ku蛋白,该蛋白也可以在病毒RNA的体外翻 译中得到。ORF3编码一个9ku蛋白,推测对ORF3的UGA终止密码子超读产生一个33ku蛋白。 ORF4编码25.1ku的外壳蛋白,在体内由共3'端亚基因组RNA表达产生。ORF1与ORF3编码蛋 白以及ORF3超读产物的功能目前还不清楚,ORF2编码蛋白及其超读产物可能是病毒的聚合酶。 A.9 抗原特性 病毒外壳蛋白由一种多肽组成,分子质量为25.1ku。病毒具有中等到强的免疫原性,在凝胶扩散 中形成单条沉淀线,与其他一些禾谷类植物病毒无血清学关系。 注:引自LommelSA。 图A.1 玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)在玉米上引起的症状 5GB/T31810—2015 注:引自LommelSA。 图A.2 玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)粒体形态 6GB/T31810—2015