ICS87.040 G50 中华人民共和国国家标准 GB/T30792—2014 罐内水性涂料抗微生物侵染的试验方法 Testmethodforresistanceofwater-bornecoatingsinthecontainer toattackbymicroorganisms 2014-07-08发布 2014-12-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中国石油和化学工业联合会提出。 本标准由全国涂料和颜料标准化技术委员会(SAC/TC5)归口。 本标准起草单位:广东省微生物研究所、中海油常州涂料化工研究院、广州秀珀化工股份有限公司、 立邦涂料(中国)有限公司、深圳广田装饰集团股份有限公司、广东千色花化工有限公司、中科纳米涂料 技术(苏州)有限公司。 本标准主要起草人:谢小保、赵玲、欧阳友生、李国荣、唐磊、李少强、欧阳振图、李家夫。 ⅠGB/T30792—2014 罐内水性涂料抗微生物侵染的试验方法 警告:使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验,本标准并未指出所有可能的安全问题, 使用者有责任采取适当的安全和健康措施,并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本方法规定了罐内水性涂料抗微生物侵染试验方法及结果评定。 本方法适用于罐内水性涂料抗微生物侵染测试,其他涂料的抗微生物侵染测试可参考本标准。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T3186—2006 色漆、清漆和色漆与清漆用原材料 取样 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 YY0569—2011 生物安全柜 3 试验原理 本测试方法模拟自然界微生物生长的环境条件,在水性涂料中加入一定数量的微生物,搅拌均匀。 再将样品置于30℃±2℃存放,并于不同的时间测定试样中微生物数量,根据试验中微生物数量动态 变化来评价罐内水性涂料抗微生物侵染功效。 4 试验条件 4.1 设备和材料 4.1.1 生化培养箱 温度能保持在30℃±1℃、36℃±1℃、28℃±1℃。 4.1.2 Ⅱ级生物安全柜 应为符合YY0569—2011规定的Ⅱ级生物安全柜。 4.1.3 天平 感量0.01g。 4.1.4 冰箱 温度可控制在4℃~8℃。 1GB/T30792—2014 4.1.5 高压灭菌锅 压力可维持在0.10MPa~0.11MPa。 4.1.6 培养皿 皿底直径为9cm。 4.1.7 锥形瓶 容量为50mL、100mL、250mL和500mL。 4.1.8 刻度吸管 1mL(具0.01mL刻度)和10mL(具0.1mL刻度)。 4.1.9 pH计或精密pH试纸 精密度0.1。 4.1.10 无菌棉签 4.2 培养基和试剂 4.2.1 试剂纯度 除另有规定,所有试验均使用化学纯或化学纯级别以上的试剂。 4.2.2 水 所用的水应为符合GB/T6682规定的三级水。 4.2.3 营养琼脂培养基(NA) 将表1中各成分加于1000mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH值至7.2~7.4。分装试管或锥形瓶, 121℃高压灭菌20min。 表1 营养琼脂培养基 成 分 含 量 蛋白胨 10.0g 牛肉膏 5.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000mL 4.2.4 马铃薯葡萄糖培养基(PDA) 将马铃薯去皮切块,加1000mL蒸馏水,煮沸10min~20min。用纱布过虑,补加蒸馏水至 1000mL。加入葡萄糖和琼脂,加热溶化,分装,121℃高压灭菌20min。成分见表2。 2GB/T30792—2014 表2 马铃薯葡萄糖培养基 成 分 含 量 马铃薯(去皮切块) 300.0g 葡萄糖 20.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 1000mL 4.2.5 稀释液 将表3中各成分加于1000mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH值至7.2~7.4。分装试管或锥形瓶, 121℃高压灭菌20min。 表3 稀释液 成 分 含 量 磷酸氢二钠 2.83g 磷酸二氢钾 1.36g 吐温80 5.0g 卵磷脂 1.0g 蒸馏水 1000mL 4.2.6 胰酪胨大豆琼脂(TSA) 将表4中各成分加于1000mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH值至7.3±0.2。分装试管或锥形瓶, 121℃高压灭菌20min。 表4 胰酪胨大豆琼脂 成 分 含 量 胰酪蛋白胨 15.0g 大豆蛋白胨 5.0g 氯化钠 5.0g 卵磷脂 1.0g 吐温80 7.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000mL 4.2.7 0.5%氯化三苯四氮唑(TTC) 将TTC溶解于蒸馏水后过滤,121℃高压灭菌20min,装于棕色试剂瓶,置4℃冰箱备用。成分 见表5。 3GB/T30792—2014 表5 0.5%氯化三苯四氮唑 成 分 含 量 TTC 0.5g 蒸馏水 100mL 4.3 试验菌种 4.3.1 细菌 大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC25922,金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538, 铜绿假单胞菌(Pseudomonasaerugimosa)ATCC10145,产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes) ATCC49701。 根据产品的用途,可增加其他细菌作为测试菌种。 4.3.2 酵母菌 白色假丝酵母(Candidaalbicans)ATCC10231,热带假丝酵母(Candidatropicalis)ATCC750。 选择一种或两种菌进行试验,根据产品的用途,可增加其他酵母菌作为测试菌种。 试验使用的菌种应由国家级或省级菌种保藏机构提供。 4.3.3 菌种保存 菌种转种后放于4℃~8℃条件下保存。储存的菌种应每一个月转种一次,须使用10代以内的 菌种。 4.4 试验准备 4.4.1 样品的准备 产品取样按GB/T3186—2006的规定进行。 4.4.2 酵母菌菌悬液的制备 将酵母菌接种于PDA斜面(见4.2.4),于28℃±1℃恒温培养48h~72h,然后加入5mL灭菌生理 盐水将斜面上的酵母菌苔洗下来,充分摇荡均匀,加入适量的灭菌生理盐水稀释制成1.0×107CFU/mL~ 9.0×107CFU/mL菌悬液,备用。 4.4.3 细菌菌悬液的制备 将四种细菌分别接种到普通营养琼脂培养基斜面(见4.2.3),36℃±1℃恒温培养24h~48h,然 后用5mL灭菌生理盐水分别将斜面上的细菌冼出,充分摇荡均匀,加入适量的灭菌生理盐水稀释,制 成1.0×108CFU/mL~9.0×108CFU/mL菌悬液,将不同细菌菌液等体积混合,备用。 5 试验方法 5.1 涂布培养法 5.1.1 试样接种 称取100g供测试的样品2份,分别接种1mL细菌菌悬液和1mL酵母菌悬液,充分混合均匀,将 4GB/T30792—2014 样品保存在30℃±2℃条件下,并于0时、第3天、第5天、第7天分别测定样品中的细菌和酵母菌含 量。如果第7天没有检测到微生物,则重新接种。 5.1.2 微生物数量检测 将2个无菌棉签分别浸入已接种的2个涂料试样中,通过在容器侧壁上轻轻挤压棉签去掉多余的 涂料(大约有200mg的涂料会留在棉签上)。将接种细菌的棉签头上的涂料均匀地涂布在TSA (见4.2.6)平板表面上,将接种酵母菌的棉签头上的涂料均匀地涂布在PDA平板表面上(相对保持在棉 签上的200mg涂料,约只有50mg的涂料会被涂在平板上),试验重复3次。TSA平板置于36℃±1℃ 恒温培养24h~48h,计数得到细菌菌落数,PDA培养基置于28℃±1℃培养48h~72h,计数得到 酵母菌落数。 如果在培养结束时培养基表面有菌落生长,则测试完成并按照5.1.4.2进行等级评价。如果在培养 结束时培养基表面没有菌落生长,则按5.1.1中规定的方法重新接种进行挑战实验,重复接种至少2次 或供需双方协商重复接种次数。 注:为便于计数,可在每100mLTSA和PDA琼脂中分别加入1mL0.5%的TTC溶液。 5.1.3 菌落计数 可用肉眼观察,必要时用放大镜,记录平板上菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-forming units,CFU)表示,细菌菌落数应采用3次重复TSA平板平均数,酵母菌落数采用3次重复PDA平板 平均数。 5.1.4 结果计算和评价 5.1.4.1 结果计算 微生物菌落数按式(1)进行计算: N=NB+NY…………………………(1) 式中: N———微生物菌落数; NB———细菌菌落数; NY———酵母菌落数。 5.1.4.2 结果评价 水性涂料抗微生物侵染功效可根据实验结束后微生物菌落数量进行评价。按表6进行分级。 表6 抗微生物侵染功效分级表 抗菌等级 微生物菌落数/cfu 污染情况描述 0 0 无污染 1 ≥1且≤9 痕量污染 2 ≥10且≤99 轻微污染 3 ≥100 污染 5GB/T30792—2014 5.2 稀释培养法 5.2.1 试样接种 将供测试的样品分成两份各100g,然后分别接种1mL混合细菌液和1mL酵母菌悬液,充分混合 均匀,将样品保存在30℃±2℃条件下,并于0时、第3天、第7天、第14天、第21天和第28天分别测 定样品中的细菌和酵母菌含量。 5.2.2 微生物检测 取10g样品加入到含90mL稀释液的锥形瓶中,充分摇匀做成1∶10的均匀稀释液;吸取1∶10 稀释液1.0mL