ICS07.060 A45 中华人民共和国国家标准 GB/T30737—2014 海 海洋微微型光合浮游生物的测定 流式细胞测定法 Determinationofmarinephotosyntheticpicoplankton— Flowcytometry 2014-06-09发布 2014-10-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布目 次 前言 Ⅰ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 术语和定义 1 ……………………………………………………………………………………………… 4 方法原理 2 ………………………………………………………………………………………………… 5 主要仪器设备 2 …………………………………………………………………………………………… 6 试剂 2 ……………………………………………………………………………………………………… 7 样品采集与处理 3 ………………………………………………………………………………………… 8 测定步骤 3 ………………………………………………………………………………………………… 9 结果分析与计算 4 ………………………………………………………………………………………… 附录A(规范性附录) 海洋微微型光合浮游生物测定流式细胞测定法采样和测定结果记录表格式7… 参考文献 10 ……………………………………………………………………………………………………GB/T30737—2014 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家海洋局提出。 本标准由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。 本标准起草单位:国家海洋局南海环境监测中心、厦门大学、国家海洋局第二海洋研究所、华东师范 大学、中国科学院南海海洋研究所。 本标准主要起草人:朱艾嘉、焦念志、黄楚光、骆庭伟、邓鸿、乐凤凤、邱大俊、李海涛、杨振雄、林端、 方宏达、许战洲、蔡伟叙、曲念东。 ⅠGB/T30737—2014 海洋微微型光合浮游生物的测定 流式细胞测定法 1 范围 本标准规定了海洋微微型光合浮游生物中原绿球藻、聚球藻和微微型真核藻类细胞数量的流式细 胞测定法。 本标准适用于海洋微微型光合浮游生物中上述3个主要类群细胞数量的流式细胞测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T12763.6—2007 海洋调查规范 第6部分:海洋生物调查 3 术语和定义 GB/T12763.6—2007界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 浮游生物 plankton 缺乏发达的运动器官,没有或仅有微弱的运动能力,悬浮在水层中,常随水流移动的生物。 注:改写GB/T12763.6—2007,定义3.9。 3.2 微微型浮游生物 picoplankton 粒径范围在0.2μm~2μm的浮游生物。 注1:微微型浮游生物不是一个严格的生物学概念,而是一个生态学概念。 注2:改写GB/T12763.6—2007,定义3.9。 3.3 微微型光合浮游生物 photosyntheticpicoplankton 能进行光合作用的微微型浮游生物。 注:微微型光合浮游生物又包括自养和异养两种类型,以自养型的占绝对优势。自养型的微微型光合浮游生物由 三个主要类群组成:原绿球藻、聚球藻和微微型真核藻类。异养型的微微型光合浮游生物主要为不产氧光合细 菌(anoxygenicphototrophicbacteria,APB)。 3.4 原绿球藻 Prochlorococcusspp.;Pro. 蓝细菌(Cyanobacteria)中的一属,为原核生物,粒径一般为0.6μm左右,其主要特征色素为二乙烯 基叶绿素(DiVinyl-Chlorophyll,DVChl)。 3.5 聚球藻 Synechococcusspp.;Syn. 蓝细菌中的一属,为原核生物,粒径一般为1μm左右,除了含有叶绿素a(Chlorophylla)外,其主 1GB/T30737—2014 要特征色素为藻胆蛋白(phycobiliprotein,PBP),包括藻红蛋白(phycoerythrin,PE)和藻蓝蛋白(phyco- cyanin,PC)。 3.6 微微型真核藻类 picoeukaryotes;Euk. 由多种隶属于不同门类的真核浮游植物组成,粒径范围在0.2μm~2μm,它们的主要色素为叶绿 素a。 4 方法原理 本方法是一种在单细胞水平上对微微型光合浮游生物细胞物理化学和生物化学性质进行快速测定 的方法。含有荧光物质的微微型光合浮游生物细胞在检测区受激光照射后,产生前向散射光、侧向散射 光和荧光。前向散射光信号表征细胞的大小和形状,侧向散射光信号表征细胞质的颗粒性,荧光信号表 征细胞的荧光物质含量。根据原绿球藻、聚球藻和微微型真核藻类上述信号的不同进行区分和计数。 5 主要仪器设备 主要仪器设备如下: a) 流式细胞仪(配备488nm激光器); b)液氮罐; c)超低温冰箱(-80℃); d)漩涡振荡器。 6 试剂 6.1 固定剂 样品可采用多聚甲醛溶液(固定终浓度为1%)或戊二醛溶液(固定终浓度为0.1%)进行固定,也可 同时加入多聚甲醛溶液和戊二醛溶液进行固定(固定终浓度分别为1%和0.05%)。多聚甲醛溶液和戊 二醛溶液获得方法如下: a)多聚甲醛溶液:市售电子显微镜用多聚甲醛溶液或自制10%多聚甲醛溶液。自制10%多聚甲 醛溶液配置方法是:在通风橱中称取10g多聚甲醛粉末放入70mL煮沸的蒸馏水中,连续搅 拌至少2h(可使用恒温磁力搅拌器);加入少量氢氧化钠(NaOH)溶液(0.1mol/L)直至溶液 澄清;加入10mL10%的磷酸盐缓冲液(PBS),调节到pH7.5;定容至100mL;用孔径为 0.2μm的注射器过滤器过滤。过滤后的多聚甲醛溶液可分装于15mL的小管中,-20℃保 存。未冻结的多聚甲醛溶液(4℃保存)使用不宜超过1周。 b)戊二醛溶液:市售电子显微镜用25%或50%戊二醛溶液。 注:上述固定终浓度均为体积百分比。 6.2 鞘液 鞘液宜使用经孔径0.2μm滤膜过滤的现场海水,也可使用超纯水。 6.3 标准荧光小球(beads)悬浮工作液 用超纯水稀释直径1μm的标准黄绿荧光小球悬浮液至浓度约为105个/μL的工作液。 2GB/T30737—2014 注:标准荧光小球在流式细胞测定时能产生固定强度的红色和橙色荧光,而且小球颗粒大小固定,因此可作为荧光 和散射光信号的内部参考物质。 7 样品采集与处理 7.1 样品采集 按GB/T12763.6—2007中7.1.1、7.1.2的规定进行。 7.2 采水量 每次采水量宜不少于30mL。 7.3 样品固定与保存 7.3.1 水样应先用孔径20μm筛绢预过滤至润洗2次~3次的清洁小烧杯中。 7.3.2 可在12h内上机分析的样品,可置于4℃避光保存。 7.3.3 样品固定保存方法如下: a)吸取预过滤水样至2mL或5mL的冻存管中,加入固定剂[见6.1a)或6.1b)],用漩涡振荡器 [见第5章d)]充分混匀,用铝箔纸包裹好,避免光照; b)在室温下放置15min后,置于液氮[见第5章b)]中速冻,然后转移到-80℃超低温冰箱[见 第5章c)]保存或直接存放在液氮[见第5章b)]中直至分析。 注:样品宜尽快分析,-80℃超低温冰箱[见第5章c)]或液氮[见第5章b)]中保存不宜超过1年,若-20℃条件 下保存则不宜超过1个月。 7.4 记录 将采样情况记录于表A.1。 8 测定步骤 8.1 测定准备 8.1.1 将鞘液(见6.2)置入流式细胞仪[见第5章a)]中,当使用过滤海水作为鞘液时,宜短接仪器内的 鞘液过滤器以防止鞘液过滤器受污染。若不短接鞘液过滤器,当鞘液过滤器受污染导致背景噪音增多 和流路不稳定等情况时,应更换鞘液过滤器。 8.1.2 开机预热。 8.2 测定方法 8.2.1 流量校准法 8.2.1.1 进行流量校准,方法如下:进样管中加入过滤海水或超纯水,测量样品重量;卸下进样针的针管 套,待鞘液滴从进样针中滴下,在下一滴鞘液滴滴下前放上进样管,还原托架位置,同时开始计时;至少 10min后取下进样管,同时停止计时,记录测定时长,测定剩余样品的重量。 流量计算用式(1): R=Wi-Wt T×d……………………(1) 3GB/T30737—2014 式中: R———流量,单位为微升每分(μL/min); T———测定时间,单位为分(min); Wi———初始重量,单位为毫克(mg); Wt———测定后所剩重量,单位为毫克(mg); d———进样管内液体密度,单位为毫克每微升(mg/μL)。 注:过滤海水d=1.03mg/μL,超纯水d=1.00mg/μL。 8.2.1.2 样品分析时,一天内校准流量不少于4次。 8.2.1.3 冷冻保存样品置于常温或37℃水浴中避光解冻备用。 8.2.1.4 吸取500μL~1000μL水样至进样管中,加入10μL标准荧光小球悬浮工作液(见6.3),用漩 涡振荡器[见5d)]混匀。 8.2.1