ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T29589—2013 香 香菜腐烂病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofMycocentrosporaacerina(Hartig)Deighton 2013-07-19发布 2013-12-06实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫 局、云南农业大学。 本标准主要起草人:种焱、王英超、邵秀玲、赵汗青、庞国兴、江丽辉、李建勇、刘云国、高文娜、刘云龙、 纪瑛、何永宏。 ⅠGB/T29589—2013 香菜腐烂病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了香菜腐烂病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于香菜、胡萝卜、元葱、杜鹃花等经济作物和观赏植物中香菜腐烂病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T1157 进出境植物苗木检疫规程 SN/T1809 进出境植物种子检疫规程 3 香菜腐烂病菌基本信息 中文名:香菜腐烂病菌。 学名:Mycocentrosporaacerina(Hartig)Deighton,1972。 异名:CercosporaacerinaHartig,1880;CercosporaohlseniiNeergaard,1942;Ansatosporamacro- sporeNewhall,1944。 病害英文名:carawaystemrot。 属于真菌界Fungi,半知菌亚门Deuteromycotina,丝孢纲Hyphomycetes,丝孢目Hyphomycetales,暗色 菌科Dematiaceae,菌刺孢属Mycocentrospora。 通过感病种子远距离传播。 香菜腐烂病菌的其他信息参见附录A。 4 方法原理 经现场查验,实验室分离培养,根据病原菌的形态特征、生物学特性,结合寄主范围进行结果判定。 5 仪器 5.1 生物显微镜(具油镜镜头)、具透射光源的体视显微镜(最大放大倍数不低于50×)。 5.2 超净工作台。 5.3 电子天平。 5.4 光照恒温培养箱。 5.5 酒精灯。 5.6 高压灭菌器。 5.7 培养皿。 5.8 医用注射器(10mL)及针头(18号)。 1GB/T29589—2013 5.9 医用手术剪、镊子。 5.10 烧杯(500mL)。 5.11 试管(直径12mm)。 5.12 载玻片、盖玻片。 5.13 量筒(500mL)。 5.14 无色透明塑料袋。 5.15 血球计数器。 6 主要试剂 蒸馏水、PDA培养基、1%次氯酸钠或70%乙醇。 7 现场检测 7.1 抽样方法 棋盘式、五点式或随机抽样。 7.2 抽样数量 7.2.1 种子 对来自香菜腐烂病菌发生国家和地区(参见附录A)的香菜、胡萝卜、芹菜等植物种子按SN/T1809 进行抽样。 7.2.2 整株植物或插枝 对芹菜、胡萝卜、杜鹃花等经济作物和观赏植物按SN/T1157进行抽样。 7.3 症状检查 对芹菜、胡萝卜、杜鹃花等经济作物和观赏植物或插枝,注意检查植株茎部上是否有腐烂和茎秆枯 萎死亡等症状,对于种子观察是否有腐烂等症状;收集上述可疑植物材料等一并带回实验室检验。 8 实验室检测 8.1 分生孢子的直接镜检观察 对于有腐烂和茎秆枯萎死亡等症状的芹菜、胡萝卜、杜鹃花等经济作物和观赏植物或插枝,以及有 腐烂等症状的种子,直接挑取症状上的霉状物镜检观察。单孢分离获得纯培养。 8.2 种子上病菌的分离和纯化 种子在1%次氯酸钠(有效浓度)中浸泡10min,然后倒去多余的溶液。后用无菌水洗3~4次。每 个培养皿中放三张9.0cm滤纸,并用无菌水浸透,倒去多余的水。在无菌条件下,在每个培养皿的滤纸 上均匀地摆放10~50粒种子,种子之间的距离最少应有20mm,间隔要均匀,一般每批次最少做400粒种 子。20℃下,12h的黑暗与12h近紫外光照交替培养8d~10d。培养皿在光管下约25cm处,不要重 叠。用肉眼或在解剖镜下挑取可疑菌落,获得纯培养。 2GB/T29589—2013 8.3 植株上病菌的分离和纯化 选取可疑病斑,用1%次氯酸钠或70%乙醇表面消毒30s左右,用无菌解剖刀在样品病健交界处 挑取2mm×2mm病健交界组织若干块,将组织置于1%次氯酸钠或70%乙醇处理的无菌平皿中 5min~10min,移入无菌水中洗三次,最后放置于PDA培养基(直径:7.5cm)平板上,每平板放置 5点,重复放置三块平板,20℃~25℃下培养2d~4d后用灭菌挑针挑取组织块边缘的菌丝,将其转移 至PDA上纯化3次获得纯培养。 8.4 病原鉴定 8.1、8.2和8.3获得的纯培养,在温度为20℃、室内光照条件下培养病原菌,观察其菌落形态、颜 色、色素,采用菌块切割保湿培养方法(见附录B)诱导分生孢子产生,观测其孢子大小、着生方式以及附 属丝的有无,综合以上进行鉴定。 8.5 致病性测定 按照附录B的方法进行接种试验。 9 鉴定特征 9.1 形态特征 9.1.1 镜检观察 将有症状病斑的种子和植株放在显微镜下观察分生孢子和分生孢子梗:分生孢子梗短菌丝状,上部 屈膝状,并具有宽而平的孢痕,淡色,通常不分枝,多无隔膜,少数具有1~2个隔膜,单生或3~5根丛 生,(18μm~65μm)×(4μm~10μm)。分生孢子单生、顶侧生,倒棍棒形,具长喙,长喙基部平截,淡 褐色,(49μm~260μm)×(6μm~15μm),4~24个隔膜,隔膜处微突起(参见附录C)。少数孢子具有 一个从基部细胞侧生出的刺状附属丝,(25μm~150μm)×(2μm~3μm)。未发现有性阶段。 9.1.2 培养观察 在PDA培养基上培养,菌丝宽4μm~7μm,后期菌丝胞壁加厚,形成念珠状串生的褐色厚垣孢 子,厚垣孢子长椭圆形或矩圆形,(15μm~30μm)×(15μm~20μm)。在人工培养基上不易产生分生 孢子,采用菌块切割保湿培养方法可获得分生孢子。 9.2 培养特征 在PDA培养基上培养,在全黑暗的条件下菌丝的生长速度最快,其颜色最初呈白色,以后逐渐变 成黑色,无玫瑰红色素的产生。光照条件下菌落初期无色,48h后变为紫红色或玫瑰红色,色素可扩散 到基质里,随菌龄增长菌落中央变为灰色直至最后变为黑色。 9.3 致病性测定 9.3.1 番茄症状:病斑初期水渍状,后变为浅褐色,病斑近圆形,随后病斑合并腐烂。叶柄和枝柄受害 呈暗褐色水渍状缢缩,病斑长梭形,脱落;茎秆受害后病斑变褐折垂。病斑表面生稀疏白色霉层。 9.3.2 胡萝卜接种症状:初期水渍状,后变为浅褐色,最后变为黑色。 9.3.3 致病菌的再分离和鉴定:用接种发病的叶片作常规病组织分离,获得的分离菌与原接种菌形态 特征相同。镜检观察在患病组织上可产生较多的分生孢子,特征与8.1描述的特征一致。 3GB/T29589—2013 10 结果判定 如现场检疫症状、分离物的形态特征、培养特征、致病性特征及再分离菌株的形态特征与7.3、第9 章所述鉴定特征吻合,可判定为香菜腐烂病菌。 11 菌种的保存 分离并最终鉴定为香菜腐烂病菌的菌株应转接到试管斜面上,经登记和经手人签字后置于4℃左 右冰箱中保存,并定期(30d~60d)转管,防止因斜面干燥而造成病原菌死亡。菌株至少需保存6个 月,保存期满后,需经灭菌处理。 4GB/T29589—2013 附 录 A (资料性附录) 香菜腐烂病菌相关资料 A.1 致病性 在低温高湿条件下引起蔬菜和观赏植物病害,如胡萝卜根腐病、芹菜冠腐病、欧防风溃疡病、报春花 根腐病等。 A.2 地理分布 A.2.1 亚洲:日本、印度尼西亚、中国(辽宁省新宾县、清原县、凤城县、桓仁县、本溪县和云南省文山州)。 A.2.2 欧洲:法国、丹麦、荷兰、挪威、英国、德国、奥地利、保加利亚、捷克。 A.2.3 大洋洲:澳大利亚、新西兰。 A.2.4 北美洲:美国、加拿大。 A.3 寄主范围 香菜腐烂病菌的寄主范围相当广泛,寄主植物已达25科50属61种,其中自然感病寄主16科 27属32种。涉及经济价值较高的经济作物和观赏植物有:伞形科中的胡萝卜(Daucuscarrot)、芹菜 (Apiumgraveolens)、欧防风(Pastinacasativa)、香菜(HerbaCoriandri),百合科的洋葱(Allium cepa),茄科的番茄(Lycopersiconesculentum),豆科的菜豆(Phaseolusvulgaris),藜科的甜菜(Beta vulgaris),十字花科的花椰菜(Brassicaoleracea),菊科的莴苣(Lactvcasaiva)、矢车菊(Centaureacya- nus)、翠菊(Callistephuschinensis),秋海棠科的四季海棠(Begoniasemperflorens),报春花科的报春花 (Primulamalacoides)、仙客来(Cyclamenpersicum),天竺葵(Pelargoniumgraveolens),杜鹃花 (Rhododendronsimsii),麝香石竹(Dianthuscaryophyllus),三色紫罗兰(Matthiolaincana)