ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T29588—2013 松 针褐斑病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofMycosphaerelladearnessiiBarr. 2013-07-19发布 2013-12-06实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、中华人民共和国昆山出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人:姚剑、廖太林、温劲松、郑海松、李刚、余晓峰、张萍、李百胜、李云飞、孙娟娟、 方元炜、戴雷、于立繁。 ⅠGB/T29588—2013 松针褐斑病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了松针褐斑病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于松属(Pinus)苗木、枝叶中松针褐斑病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 松针褐斑病菌基本信息 中文名:松针褐斑病菌。 学名:MycosphaerelladearnessiiBarr。 异名:Scirrhiaacicola(Dearness)Siggers,Systremmaacicola(Dearness)Wolf&Barbour。 属真菌界Fungi,子囊菌亚门Ascomycota,腔菌纲Loculoascomycetes,座囊菌目Dothideales,座囊 菌科Dothideaceae,球腔菌属Mycosphaerella。其无性型为半知菌亚门Deuteromycotina,腔孢纲Coe- lomycetes,黑盘孢目Melanconiales,黑盘孢科Melanconiaceae,座盘孢属Lecanosticta中的Lecanosticta acicola(Thümen)SydowetPetrak[异名:LecanostictapiniSydow,Septoriaacicola(Thümen)Sac- cardo]。 松针褐斑病菌以子实体和病斑组织中的菌丝体在树上病叶或落地病叶上越冬,其有性型偶见于凋 落的针叶上。 松针褐斑病菌的其他信息参见附录A。 4 方法原理 经现场查验、取样后,实验室用显微镜等仪器设备进行检测,根据其危害症状、形态学特征进行结果 判定。 5 仪器及用具 5.1 仪器 显微镜,超净工作台,恒温箱,高压灭菌锅。 5.2 用具 解剖刀,剪刀,镊子,放大镜。 1GB/T29588—2013 6 试剂和培养基 6.1 试剂 2%次氯酸钠,70%酒精。 6.2 培养基 PDA培养基。 7 现场检验 7.1 抽样方法 按SN/T2122进行抽样。 7.2 现场查验 搜集并检查针叶是否有褪色小斑点或呈三段不同颜色的段斑,即上段褐色枯死,中段褐色、绿色相 间,下段为绿色。进一步观察针叶两面表皮下叶肉组织中,有无块状或纽扣状、长度为1mm左右的圆 形或近似圆形的黑色小点。凋落的松针上是否有黑色、不规则分布的症状。将疑似感病样品带回实验 室作进一步检验。 8 实验室检验 8.1 切片检验 选取带黑色小点针叶,用剪刀剪取带有黑色、圆形或近似圆形斑点的针叶组织(约5mm)切片,从 中选择薄而带有完整黑色小点部分的切片,用移植环移于载玻片中央的水滴中,在显微镜下观察分生孢 子盘、分生孢子梗以及分生孢子特征或病原菌有性型相关症状。 如针叶病斑无子实体或子实体未成熟,可将有病针叶在25℃~30℃条件下保湿培养,待长出子实 体并成熟后再做切片镜检。时间约需20d。 8.2 分离培养 在典型病斑中切取小块病组织,在70%酒精中浸30s,或用2%次氯酸钠消毒60s,用无菌水冲洗 3次后置于PDA平板上,25℃恒温培养。观察菌落生长性状,12d后镜检。 8.3 形态观察 从菌落中挑取少许培养物,以水作浮载剂,制成玻片,在显微镜下观察。如为松针褐斑病菌的无性 型,则可观察到分生孢子盘、分生孢子梗和分生孢子。详细记录并测量分生孢子梗和分生孢子大小。 9 鉴定特征 9.1 病菌形态特征 无性型[Lecanostictaacicola(Thümen)SydowetPetrak]分生孢子盘在针叶表皮下的叶肉组织 中,块状或纽扣状,黑色,高75μm~225μm,宽100μm~275μm,长度变化大,可达1mm以上,上方平 2GB/T29588—2013 展或呈浅盘状。分生孢子梗无色至灰褐色,不分枝,(15μm~25μm)×3μm。分生孢子梭形至长形, 直或不规则弯曲,两端较狭窄,先端钝尖,下端平截,无色至暗褐色,1个~6个隔膜,多数3隔, (24.5μm~51.0μm)×(3.4μm~6.3μm),平均37.9μm×4.2μm。马尾松针叶上产生的分生孢子 略短而肥,不同寄主针叶上产生的分生孢子与分离培养的稍有差异。 有性型(MycosphaerelladearnessiiBarr)子囊座散生,线形,生于表皮下后突出,使寄主表皮开裂 拱起高于针叶表面30μm~50μm;黑色,多腔,(400μm~850μm)×(120μm~250μm),偶见单腔,腔 壁由假薄壁组织构成。子囊腔通常12个以上排成一列或三列,球形或烧瓶形,(60μm~70μm)× (50μm~65μm),有孔口,有缘丝,无侧丝。子囊双层壁,含8个孢子,无色,囊状或圆筒状,(30μm~ 55μm)×(6.5μm~10.5μm),顶端圆。子囊孢子呈一行或不规则两行,无色,一分隔,长圆形或楔形, 一端圆,一端梭形,(7.5μm~12.5μm)×(2μm~3μm),典型的具四油滴。精子器阶段属 Asteromella型,子座单腔或多腔,精子近无色至灰绿色,(2μm~4μm)×(0.8μm~1.3μm),杆状(参 见附录B)。 9.2 培养性状 在PDA培养基上,菌丝生长良好。组织分离4d可见白色菌落,10d后菌落底部淡褐色,开始形成 黑色隆起子座,12d以后子座出现具油漆光泽的分生孢子堆,16d以后菌落直径达6mm~10mm。 9.3 与松针红斑病菌DothistromapiniHulbary的区别 松针红斑病菌分生孢子无色,壁薄光滑,在PDA培养基上培养产生红色素和红色晶体,在松针上 引起带红色的病斑。Lecanostictaacicola分生孢子为茶褐色或烟褐色,壁厚,上布黑色疣状突起,在 PDA培养基上不产生红色素和红色晶体,松针上病斑为褐色而不是红色。 10 结果判定 如症状与描述症状吻合,且切片或分离培养观察的病菌形态特征与描述的病原有性型或无性型的 特征相符,即可鉴定为松针褐斑病菌。 11 样品、菌种保藏 分离菌转接在PDA培养基斜面上,待斜面表面长满菌丝后,置于4℃保存,定期转接。有条件可进 行冷冻干燥保存。 检出病菌的样品妥善保存6个月。保存期满灭活处理。 3GB/T29588—2013 附 录 A (资料性附录) 松针褐斑病菌的分布 松针褐斑病菌分布于以下地区: a) 欧洲:法国、德国、瑞士、前南斯拉夫、格鲁吉亚。 b) 北美洲:加拿大、墨西哥、美国。 c) 中美洲以及加勒比海地区:伯利兹、哥斯达黎加、古巴、危地马拉、洪都拉斯、牙买加。 d) 南美洲:哥伦比亚。 e) 亚洲:中国(河北、辽宁、吉林、江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、河南、湖南、广东、广西)。 f) 非洲:南非。 4GB/T29588—2013 附 录 B (资料性附录) 症状及病原菌形态特征 松针褐斑病病状见图B.1、图B.2,病原菌形态特征见图B.3、图B.4。 图B.1 松针褐斑病感病症状 图B.2 松针褐斑病病叶病斑 5GB/T29588—2013 图B.3 松针褐斑病菌分生孢子 图B.4 松针褐斑病菌分生孢子盘 6GB/T29588—2013