ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T29585—2013 剪 股颖粒线虫检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofAnguinaagrostis(Steinbuch)Filipjev 2013-07-19发布 2013-12-06实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国青岛出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人:王金成、杨秀丽、崔铁军、张治宇、刘鹏、廖芳、张裕君、牛春敬。 ⅠGB/T29585—2013 剪股颖粒线虫检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了剪股颖粒线虫的检疫和鉴定方法。 本标准适用于草籽及其他植物材料中剪股颖粒线虫的检疫及其鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 剪股颖粒线虫基本信息 中文名称:剪股颖粒线虫。 英文名称:bentgrassnematode。 学名:Anguinaagrostis(Steinbuch,1799)Filipjev,1936。 分类地位:线虫门(Nematoda)、侧尾腺纲(Secernentea)、垫刃目(TylenchidaThorne,1949)、粒线 虫科[AnguinidaeNicoll,1935(1926)]、粒线虫属(AnguinaScopoli,1777)。 带虫种子、虫瘿、植物病残组织是剪股颖粒线虫传播的主要载体。 剪股颖粒线虫的其他信息参见附录A。 4 方法原理 现场检测获取样本,通过显微镜观察和分子生物学方法获取形态和核酸信息鉴定特征,进行鉴定。 5 仪器、用具 5.1 仪器:显微镜(100×~1000×,具有目镜测微尺或绘图仪、图像捕获装置、测量软件)、体视显微镜 (10×~80×,具透射光源)、冰箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、低速离心机(1000r/min~5000r/min)、纯 水仪。 5.2 用具:线虫挑针、载玻片、盖玻片、酒精灯、移液器(1000μL、100μL、10μL、2.5μL)、钟面皿 (ϕ7cm、ϕ9cm)、培养皿(ϕ7cm、ϕ9cm)、浅盘、套筛(400目、500目)、改进的贝尔曼漏斗、加热板、打孔 器、解剖刀。 6 试剂 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂或双蒸水。 6.1 玻片封固剂、4%甲醛溶液、石蜡。 1GB/T29585—2013 6.2 10×PCR缓冲液(-20℃保存)、25mmol/L氯化镁(-20℃保存)、2.5mmol/LdNTP’s(-20℃保 存)、5U/μLTaq酶(-20℃保存)、TAE或TBE电泳缓冲液、琼脂糖、溴酚蓝载样缓冲液(6×TAE缓冲 液、60%甘油、0.3%溴酚蓝,4℃保存)、溴化乙锭(EB,避光保存)、DNAladdermarker(-20℃保存)。 6.3 剪股颖粒线虫rDNA-ITS质粒克隆(-20℃保存)。 7 现场检测 7.1 抽样 按照SN/T2122抽取进出境的草籽、植物样品。 7.2 外观症状的检查和取样 剪股颖粒线虫主要侵染植物的花序,被寄生的小花的颖片、外稃和内稃显著伸长,其内的子房变成 雪茄状的虫瘿;虫瘿开始形成时为绿色,后变为褐色。收集上述可疑的草籽、植物材料带回实验室检验。 8 实验室检验 8.1 线虫分离 8.1.1 浅盘和漏斗法:直接分离待检样品,室温(25℃左右)条件下分离12h~24h,可获得线虫。 8.1.2 人工筛检虫瘿:对于草籽,除浅盘和漏斗法直接分离样品外,可根据剪股颖粒线虫危害寄主引起 的症状特点人工挑拣虫瘿,获得虫瘿后,在清水中浸泡1h~2h,体视显微镜下挑针轻压,也可获得 线虫。 8.2 显微观察、摄影和测量 在体视显微镜下挑取线虫若干条制成临时玻片在显微镜下镜检,观察线虫的形态结构。同时对线 虫进行拍照、测量。当虫量足够时,拍摄测量的雌虫、雄虫或幼虫数目应在15条以上。 8.3 分子生物学检测 对形态学观察可疑的线虫幼虫应进行分子生物学检测。 9 鉴定与检测 9.1 形态学鉴定 9.1.1 粒线虫属形态鉴定特征 成熟雌虫肥大,体型中等到大,长1mm~2.7mm,呈螺旋形。中食道球有瓣;后食道腺膨大,与狭 部之间连续或缢缩,通常覆盖肠,偶尔不覆盖肠。雌虫卵巢前部转折,卵母细胞围绕一中轴多行排列,子 宫柱状部由多行不规则细胞排列构成。雄虫精原细胞多行排列;有引带;交合伞亚端生,长但不伸到尾 端。一般在寄主植物地上部形成虫瘿。 9.1.2 剪股颖粒线虫形态鉴定特征 9.1.2.1 雌虫:虫体粗壮,经热杀死后向腹面卷曲成螺旋形,角质膜表面环纹细,在成虫的虫体上难于 观察到侧带区。唇区低平,缢缩。垫刃型食道,食道前体部圆柱形,中部略膨大,与中食道球连接处稍缢 2GB/T29585—2013 缩;狭部短而窄;后食道腺发达,梨形,不呈明显耳叶状,不覆盖肠的前端或稍覆盖。前生殖腺发达,卵巢 常折叠2次,卵母细胞围绕一中柱轴状多行排列,受精囊长梨形,与输卵管连接处稍缢缩分开,子宫内常 有多个卵同时存在。后阴子宫囊的长度为肛阴距的一半,内充满精子。尾锥形,尾端锐尖。 9.1.2.2 雄虫:虫体比雌虫短而细,经热杀死后一般呈弓形。精巢常回折1次,精母细胞多行排列。交 合刺比小麦粒线虫A.tritici的纤细,近端部向腹面折或不折,引带细线形。交合伞亚端生。尾端锐尖。 9.1.2.3 2龄幼虫:除生殖系统未发育及虫体较小外,其余形态结构与成虫相似。 9.1.2.4 近似种:小麦粒线虫A.tritici。两者的区别是:小麦粒线虫尾端钝圆,交合刺中部明显增粗, 基端头状突腹折,引带槽状,寄生小麦和燕麦;而剪股颖粒线虫则是尾端尖,交合刺中部仅略增粗,基端 头状突不腹折或略腹折,引带细线状,寄生牧草。 9.1.3 剪股颖粒线虫形态特征图 参见附录B。 9.1.4 剪股颖粒线虫测计值 见表1。 表1 剪股颖粒线虫形态测量数据 测量项目 和参数剪股颖分离物 早熟禾和假梯草分离物 雌虫 雄虫 2龄幼虫 雌虫 雄虫 2龄幼虫 L/mm 1.39~2.601.05~1.450.55~0.822.52~4.141.54~2.310.81~1.25 a 13.8~25.423.8~30.047.2~65.021.8~30.721.6~34.443.5~71.0 b 12.6~28.76.5~8.9 3.2~4.510.3~26.56.8~11.64.0~6.1 c 25.2~43.021.5~28.411.7~20.028.8~48.920.4~32.712.1~15.4 V 87~92 — — 90~92 — — 口针/μm 10~12 10~12 10 10~12 10~12 10 交合刺/μm — 25~32 — — 30~37 — 引带/μm — 10~13 — — 13~15 — 注:L:线虫体长;a:体长/最大体宽;b:体长/虫体前端至食道腺与肠连接处的距离;c:体长/尾长; V:虫体前端至阴门的距离×100/体长。 9.2 分子生物学检测 见附录C。 10 结果判定 符合9.1形态特征的粒线虫成虫,可判定为剪股颖粒线虫;符合9.1形态特征的粒线虫幼虫,经9.2特 异引物扩增获得的PCR产物约为500bp,同时阳性对照的PCR产物约为500bp,空白对照无PCR产物 时,也可判定待检线虫为剪股颖粒线虫。 3GB/T29585—2013 11 样品保存 11.1 如果鉴定结果为剪股颖粒线虫,则将剩余的线虫杀死,置于4%甲醛固定液中或制成永久玻片长 期保存。 11.2 对已经鉴定出带有剪股颖粒线虫的植物材料,保存在低温干燥、防鼠防虫处,并注明样品编号、截 获日期、截获人、寄主名称、运输工具、输出国名等。样品保存期为1年,有特殊需求保存期可适当延长, 以备复验、谈判和仲裁。保存期满,经灭活后妥善处理。 4GB/T29585—2013 附 录 A (资料性附录) 剪股颖粒线虫的其他信息 A.1 地理分布 中国(内蒙古局部)、爱沙尼亚、德国、俄罗斯、法国、芬兰、格鲁吉亚、荷兰、瑞典、乌克兰、英国、南非、 澳大利亚、新西兰、加拿大、美国(太平洋沿岸)。 A.2 寄主植物 A.2.1 剪股颖属草类:细弱剪股颖Agrostistenuis、小糠草A.alba、绒毛剪股颖A.canina、糙叶剪股颖 A.exarata、匍匐剪股颖A.palustris、匍茎剪股颖A.stolonifera等。 A.2.2 其他禾本科牧草和杂草:Aperaspicaventi、Arcatagrostislatifolia、野牛草Buchloe dactyloides、加拿大拂子茅Calamagrostiscanadensis、兰斯多夫拂子茅C.langsdorfii、Digraphis arundinasea、羊茅Festucaovina、紫羊茅F.rubra、芒麦草Hordeumjubatum、Koeleriaglauca、黑麦草 Loliumperenne、假梯牧草Phleumphleoides、高原早熟禾Poaalpina、早熟禾P.annua、六月禾 P.pratensis、海滨硷草Puccinellia、maritima、S