ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T29584—2013 黄 瓜黑星病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofCladosporiumcucumerinumEll.etArthur 2013-07-19发布 2013-12-06实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫 局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:杨永生、罗志萍、吕国忠、陈青、敖威华、郭铁筝、尹凤民、张永宏、朱子平、白桦、 李刚。 ⅠGB/T29584—2013 黄瓜黑星病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了黄瓜黑星病菌CladosporiumcucumerinumEll.etArthur以植株症状、病原菌形态 特征为依据的检疫鉴定方法。 本标准适用于黄瓜及其他葫芦科植物的种子、秧苗上黄瓜黑星病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T1157 进出境植物苗木检疫规程 SN/T1809 进出境植物种子检疫规程 3 黄瓜黑星病菌基本信息 中文名称:黄瓜黑星病菌。 学名:CladosporiumcucumerinumEll.etArthur1889。 异名:ScolecotrichummelophthorumPrill.&Delacr1891; MacnosporiummelophthorumPostrup1893; CladosporiumcucumerisFrank1893; CladosporiumscabiesCooke1903。 病害英文名:cucumberscab。 属于真菌界Fungi,有丝分裂孢子真菌Mitosporicfungi。该病菌的有性型为子囊菌门球腔菌科 Mycosphaerellaceae、球腔菌属MycosphaerellaJohanson。在传统分类上,该菌属于半知菌亚门Deu- teromycotina、丝孢纲Hyphomycetes、丝孢目Hyphomycetales、暗色孢科Dematiaceae、枝孢属Clados- porium。 黄瓜黑星病菌的其他信息参见附录A。 4 方法原理 通过现场检查植株症状、实验室检验,利用病原菌在寄主植株上的症状、病原菌的形态学特征、致病 性测定等依据进行鉴定。 5 仪器及用具 5.1 体视解剖镜。 5.2 生物显微镜。 5.3 高压灭菌锅。 1GB/T29584—2013 5.4 生物培养箱。 5.5 超净工作台。 5.6 pH计。 5.7 电子天平。 5.8 冰箱。 5.9 培养皿、镊子、解剖刀、载玻片、盖玻片、酒精灯。 6 试剂和培养基 6.1 次氯酸钠。 6.2 葡萄糖。 6.3 琼脂。 6.4 酒精。 6.5 PDA培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂17g~20g。马铃薯切块煮沸10min,纱布过滤,加 入葡萄糖、琼脂,pH值至6~8,加水定容至1000mL,121℃高压灭菌20min,分装备用。 7 现场检测 7.1 现场植株症状检查 按照SN/T1157规定执行。 现场检查中根据黄瓜黑星病在秧苗、瓜条下的症状,将具有典型症状及疑似症状的叶片、茎蔓、果实 用塑料袋装好,加贴标识后送实验室进行病原菌分离和鉴定。 7.2 种子抽样 按照SN/T1809规定执行。 8 实验室检测 8.1 植株病组织检测 从现场检疫中采集的感病植物组织上挑取灰黑绿色霉层或用刀片于叶背病斑处刮取病菌子实体, 移于载玻片中央的水滴中,盖上盖玻片,进行显微镜检观察。 8.2 种子检测 8.2.1 PDA培养基培养法 取试验样品种子400粒,经3%~5%次氯酸钠消毒5min~15min,将以上处理的种子按每皿 10粒~15粒摆放于PDA平板上,置于20℃~22℃恒温箱中培养7d~11d,待长出菌落后,挑选典型 菌株,接种在PDA培养基上进行纯化培养,待形成子实体后进行显微镜检观察。 8.2.2 致病性测定 选用黄瓜感病品种(如津杂2号)在温室培养至长出两片真叶的幼苗,将待测菌株制备成孢子悬浮 2GB/T29584—2013 液(浓度为2×106个孢子/mL),采用喷雾接种法接种黄瓜幼苗,罩上塑料袋保湿过夜,在20℃~22℃ 条件下孵育7d~14d,进行症状检查,并对病原菌进行显微镜检观察。 9 鉴定特征 9.1 植株症状特征 9.1.1 叶片症状 叶片受害初期为近圆形褪绿色小斑点,后扩展成直径2mm~3mm黄白色圆形病斑,后期病斑易 呈星状开裂穿孔,孔洞边缘锯齿状,周围叶组织扭皱;病斑具黄白色晕圈,后期不明显。 叶脉上病斑一般为长纺锤形,后形成木栓化组织龟裂。 9.1.2 茎、叶柄、果柄、卷须症状 茎、叶柄、果柄处初呈水浸状暗绿色梭形病斑,大小不等,最长可达4cm左右,淡黄褐色,中间开裂 下陷、龟裂,少数病斑开裂深度可达2mm~3mm。发病初期,病斑处有透明分泌物,后变为琥珀色胶 状物,胶状物脱落后,病斑龟裂成疮痂状。空气湿度大时,病斑长出灰黑绿色霉层。 卷须顶端及中间易被侵染,病斑长梭形,受害部分变为褐色或黑褐色,呈成段萎蔫,直至整个卷须干 枯,失去功能。 9.1.3 果实症状 瓜条被害病斑龟裂成疮痂状,果实畸形,病斑凹陷一般深2mm~3mm,最深可达5mm,病瓜一般 不腐烂。病斑处溢出半透明胶状物,后变为琥珀色。空气湿度大时,病斑上长出灰黑绿色霉层。(参见 附录B中的图B.1) 9.2 病原菌特征 9.2.1 培养性状 PDA培养基上菌落为圆形、平展、绒状、灰黑绿色。菌丝白色至灰色,具分隔,具分枝。菌丝白色至 灰色、有时卷曲。菌落背面为绿黑色。 9.2.2 形态特征 分生孢子梗细长,单生或丛生,淡褐色至褐色,基部常膨大,顶部或近顶部有少量分枝,大小平均为 (76μm~380μm)×(3.2μm~5μm)。分生孢子芽殖,串生,形成分枝的长链,淡褐色至褐色,椭圆形或 柠檬形,多数单胞、少数具一隔,分隔处略缢缩。光滑或具微刺,大小差异很大,单胞孢子大小平均为 (3.8μm~23.5μm)×(2.5μm~6μm);双胞孢子大小平均为(4μm~25μm)×(2μm~6μm)(参见 附录B中的图B.2)。 10 结果判定 植株症状符合9.1的特征,其染病组织上分离的病原菌形态特征符合9.2中的描述;种子在PDA 培养基上培养的病原菌特征符合9.2中的描述,经致病性测定植株表现症状符合9.1的病原菌均可判 定为黄瓜黑星病菌(黄瓜黑星病菌及近似种类的分类检索表参见附录C、形态特征图参见附录D)。 3GB/T29584—2013 11 菌种保藏 分离并鉴定的菌株需转接在PDA培养基的斜面上,待斜面表面布满菌丝后,置于4℃冰箱保存。 有条件可进行冷冻干燥保藏菌种。保存期满后灭活处理。 4GB/T29584—2013 附 录 A (资料性附录) 黄瓜黑星病菌其他信息 A.1 分布 亚洲:日本、中国、土库曼斯坦、巴基斯坦、吉尔吉斯斯坦、泰国、印度、柬埔寨、哈萨克斯坦、塞浦路斯、格 鲁吉亚、阿塞拜疆、乌兹别克斯坦。 欧洲:丹麦、西班牙、荷兰、意大利、德国、捷克、斯洛伐克、奥地利、瑞士、瑞典、罗马尼亚、法国、波兰、爱尔 兰、英国、比利时、前南斯拉夫、卢森堡、俄罗斯、匈牙利、芬兰、爱沙尼亚、拉脱维亚、乌克兰、立陶 宛、挪威、保加利亚。 美洲:哥斯达黎加、巴拿马、萨尔瓦多、危地马拉、加拿大、墨西哥、美国、阿根廷、哥伦比亚。 大洋洲:澳大利亚、新西兰、新喀里多尼亚。 非洲:南非、摩洛哥、毛里求斯、津巴布韦、肯尼亚、马拉维。 A.2 寄主 黄瓜CucumissativusL.、笋瓜CucumismaximaDuch.、葫芦Lagenariasiceraria(Molina) Standl、丝瓜Luffacylindrica(L.)Roem、苦瓜MomordicacharantiaL.和其他葫芦科植物。 5GB/T29584—2013 附 录 B (资料性附录) 黄瓜黑星病植株症状照片及病原菌形态特征图 1) 引自EllisM.B.1971。黄瓜黑星病植株症状照片及病原菌形态特征见图B.1、图B.2。 图B.1 黄瓜黑星病植株症状照片 图B.2 黄瓜黑星病病原菌形态特征图1) 6GB/T29584—2013