ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T29582—2013 花 生矮化病毒检疫鉴定方法 Detectionandidentificationofpeanutstuntvirus 2013-07-19发布 2013-12-06实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫 局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:于翠、杨翠云、印丽萍、郑耘、廖富荣、郑建中、易建平。 ⅠGB/T29582—2013 花生矮化病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了花生矮化病毒检疫鉴定方法。 本标准适用于活体植物材料,包括无性繁殖材料、组培苗、种子和苗木中花生矮化病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T1840 植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 花生矮化病毒基本信息 中文名:花生矮化病毒。 英文名:Peanutstuntvirus。 异 名:groundnutstuntvirus;peanutstuntcucumovirus;robiniamosaicvirus;cloverblotch virus;peanutcommonmosaicvirus。 缩 写:PSV。 属雀麦花叶病毒科Bromoviridae,黄瓜花叶病毒属Cucumovirus。 花生矮化病毒的其他信息参见附录A。 4 方法原理 利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(doubleantibodysandwichenzyme-linked immunosorbentassay,DAS-ELISA)、体外反转录和体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应 (reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)进行检测鉴定。 5 仪器设备、设施、用具和试剂 5.1 仪器 PCR仪、超净工作台、电子天平(0.001g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、电子透射显微镜、水浴 锅、高速冷冻离心机、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡器。 5.2 设施 隔离温室(10℃~30℃)。 5.3 用具 可调式微量移液器(2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL)及相应的无RNase吸头、无 RNase离心管、PCR管和研钵等。 1GB/T29582—2013 5.4 试剂 病毒检测试剂盒、Trizol、焦碳酸二乙酯(DEPC)、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、β-巯基乙 醇、AMV反转录酶、TaqDNA聚合酶、DNA分子标记、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。血清学和分子生 物学试剂配制参见附录B。 注:除有特殊说明外,所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂。 6 检测 PSV的症状根据寄主植物和病毒株系的不同而变化,自然感染的植物症状是持久的。在花生 (ArachishypogaeaLinn.)上有不同程度的矮化、节间缩短、叶片变小、轻斑驳、豆荚畸形。在菜豆 (PhaseolusvulgarisLinn.)上,小三叶表现褪绿斑驳和花叶,而有些栽培种的小三叶变长,不能长成正 常的叶片;烟草(NicotianatabccumLinn.),表面严重的斑驳,整株植物褪绿,或有褪绿斑并有橡树叶状 的叶片;羽扇豆(LupinusmicranthusGuss.),叶片、花器畸形,植株矮化。当寄主植物表现症状时,可根 据症状采样;当寄主植物无症状时,则可以按SN/T2122中规定的抽样方法进行。 7 鉴定 7.1 鉴定流程 有多种方法可对PSV进行检测鉴定。免疫电镜是一种快速方法,但是仅能对少量病毒含量高的样 品进行检测,且需要透射电镜这样的贵重仪器。PT-PCR作为单一方法能够快速灵敏地进行检测,但是 需要实验室人员具备相当的专业技能。ELISA方法是一种快速、简单易学且需试验设备最少的方法, 但是某些株系由于血清学关系远而可能被漏检。通常初筛时,根据样品量的多少选择ELISA或 RT-PCR方法。具体操作流程可参照图1。鉴定样品是否带毒应两种或两种以上的方法相互验证。 图1 PSV鉴定流程图 2GB/T29582—2013 7.2 双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA) 对种苗叶片或由种子催生长出的第一对真叶研磨,并按植物组织重量和抽提缓冲液1∶10的比例 稀释,制备的汁液分别盛装于离心管中,低速离心后吸取上清液待用于ELISA检测。具体检测步骤见 附录C。 7.3 RT-PCR检测 植株叶片或种子液氮研细,取0.1g用于提取植物总RNA。RT-PCR具体操作步骤见附录D。 7.4 生物学检测 在室温(20℃~25℃)条件下,栽种于检疫隔离温室中的昆诺藜或苋色藜、菜豆、普通烟、豇豆、番 茄等鉴别寄主植物第一对真叶长出后可作为指示植物用于摩擦接种。对经DAS-ELISA或RT-PCR检 测阳性的植株或种子,加入适量接种缓冲液研磨成汁液后接种指示植物。当任意一种指示植物出现如 下描述症状时,即可判定接种成功: a) 苋色藜或昆诺藜(Chenopdiumamaranticolor,C.quinoa):接种叶出现褪绿斑,后系统叶出现 褪绿斑和花叶; b) 菜豆(PhaseolusvulgarisLinn):褪绿或局部坏死斑,系统褪绿花叶或仅有花叶症状(不同栽培 种上的症状也不同); c) 普通烟(N.tabacum):接种叶上有直径5mm~10mm的线黄绿色环,系统感染的新叶上有褪 绿区; d) 豇豆(Vignaunguiculata):第一叶接种后的4d~5d产生褪绿斑,2d~3d后小三叶表现脉 明和向上束起; e) 番茄(LycopersiconesculentumLinn):表现为类似感染黄瓜花叶病毒或番茄不孕病毒所引起 的蕨叶的叶片呈带状。 7.5 免疫电镜检测 按照SN/T1840中的方法进行电镜观察病毒粒子形态。在免疫电镜下如观察到直径为29nm的 病毒球状粒子,即可判定免疫电镜结果阳性。 8 结果判定 当DAS-ELISA结果阳性,且同时7.3、7.4或7.5中任一结果为阳性时,可判定样品携带有花生矮 化病毒;当RT-PCR结果阳性,且同时7.2、7.4或7.5中任一结果为阳性时,也可判定样品携带有花生 矮化病毒。 9 样品与记录结果保存 9.1 经检验确定携带花生矮化病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在干燥条件 下,其他情况取试验样品保存在-20℃冰箱中,有条件的保存在-80℃冰箱中更好。做好登记和标记 工作。 9.2 记录包括:样品来源、种类,取样人员,试验的时间、地点、方法和结果,检验检疫员的签字等。酶联 免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片,RT-PCR检测应有 电泳结果照片及序列测定分析。 3GB/T29582—2013 附 录 A (资料性附录) 花生矮化病毒其他信息 A.1 寄主范围 PSV自然侵染大豆、花生、菜豆、刺槐、烟草、豌豆以及三叶草等多种豆科牧草。 A.2 为害症状 PSV影响寄主植物的整个生长期。典型症状为节间缩短、叶片变小、褪绿、畸形;在某种程度上,中 期感染的症状与番茄斑萎病毒属引起的症状相似。早期感染的植株几乎不产生种子或种子不明显。 PSV的症状根据主寄植物和病毒株系的不同而变化。自然感染的植物的症状是持久的。 A.3 分布地区 欧洲:法国、匈牙利、意大利、波兰、西班牙。 亚洲:印度,日本,朝鲜半岛,中国的河北、山东、河南、江苏等省。 非洲:摩洛哥、苏丹。 美洲:美国。 A.4 传播方式 A.4.1 介体传播 PSV可由蚜虫以非持久性方式传播。介体的获毒时间不到1min,传毒时间不到1min,无潜伏期, 病毒不传给幼蚜。在试验条件下易摩擦接种。 A.4.2 种子传毒 可通过花生种子传给下一代植株,PSV从花生的种子传给幼苗的百分率低(大约0.1%)。大豆是 否可种传该病毒,目前还无定论,有报道种传率可达3%~4%,也有报道不种传。尚无其他植物种子传 播PSV的报道。 A.4.3 其他传染源 在美国,病毒可在白三叶草、烟草、菜豆上越冬,这几种植物是感染源。 A.5 粒体形态 PSV粒体为等轴对称二十面体,直径29nm。 4GB/T29582—2013 A.6 基因组 PSV基因组为三分体基因组,每个病毒粒子包裹有单分子的RNA1或RNA2,或者RNA3和 RNA4。存在广泛的株系分化现象,根据分子遗传亲缘关系将PSV划分为三个亚组。 5GB/T29582—2013 附 录 B (资料性附录) 试剂配置 B.1 10×PBST缓冲液(pH7.4) 氯化钠(NaCl) 80g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 2g 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 11.5g 氯化钾(KCl) 2g 吐温-20(Tween-20) 5mL 溶于900mL的蒸馏水中,用浓盐酸(HCl)调节pH至7.4,并定容至1000mL。 B.2 样品抽提缓冲液(pH7.4) 亚硫酸钠(Na2SO3) 1.3g 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP) 20g 叠氮钠(NaN3)