ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T29577—2013 腐 烂茎线虫检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofDitylenchusdestructorThorne 2013-07-19发布 2013-12-06实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人:江丽辉、李一农、汪万春、李芳荣、赵汗青、吕玉峰、韩晶、龙海、高文娜、边勇。 ⅠGB/T29577—2013 腐烂茎线虫检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了腐烂茎线虫(DitylenchusdestructorThorne)的检疫鉴定方法。 本标准适用于蔬菜和花卉的块茎、鳞茎、球茎等根茎部分,其他寄主植物种子、茎、叶及栽培介质中 腐烂茎线虫的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T1141—2002 鳞球茎茎线虫检疫鉴定方法 SN/T1157 进出境植物苗木检疫规程 SN/T1158 进出境植物盆景检疫规程 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 腐烂茎线虫基本信息 中文名:腐烂茎线虫;马铃薯腐烂茎线虫。 英文名:potatorotnematode;tuberrotnematode。 学 名:DitylenchusdestructorThorne,1945。 腐烂茎线虫隶属于线虫门Nematoda(Rudolphi,1808)Lankester,1877,侧尾腺纲Secernenteavon Linstow,1905、垫刃目TylenchidaThorne,1949、粒线虫科AnguinidaeNicoll,1935(1926),茎线虫属 DitylenchusFilipjev,1936。 腐烂茎线虫主要通过寄主植物的块芭、鳞茎、球茎及栽培介质进行远距离传播。 腐烂茎线虫的其他信息参见附录A。 4 方法原理 采集疑似寄主植物材料进行线虫分离,用显微镜观察分离到的线虫,依据腐烂茎线虫的雌虫和雄虫 的形态学特征进行形态学鉴定,双重PCR分子生物学检测方法是腐烂茎线虫的重要辅助鉴定手段。 5 仪器用具 5.1 仪器 生物显微镜(100×~1000×)、体视显微镜(10×~80×,具透射光源)、冰箱、电热恒温箱、PCR仪、 电泳仪、凝胶成像系统、低速离心机(1000r/min~5000r/min)、纯水仪。 5.2 用具 改进型漏斗分离器、移液器(10μL、25μL、100μL、1000μL);其他用具参见SN/T1141—2002中 1GB/T29577—2013 的第3章所列的用具。 6 试剂 6.1 形态学鉴定用试剂 参见SN/T1141—2002中的第4章所列试剂。 6.2 分子检测试剂 WLB(500mmol/L氯化钾、10mmol/LTris-盐酸、pH8.0、15mmol/L氯化镁、1.0mmol/L DTT、4.5%吐温20)、蛋白酶K(600mg/mL)、10×PCR缓冲液(-20℃保存)、25mmol/L氯化钙溶 液(-20℃保存)、dNTP(10mmol/L)、Taq酶(5U/μL,-20℃保存)、6×载样缓冲液、TAE或TBE 电泳缓冲液、琼脂糖、溴酚蓝载样缓冲液(6×TAE缓冲液,60%甘油,0.3%溴酚蓝;4℃保存)、溴化乙 锭(EB,避光保存)、DNAladdermarker(-20℃保存)、DNA凝胶回收试剂盒(室温保存)、EcoRI酶 (-20℃保存)、大肠杆菌DH5α感受态细胞(-70℃保存)、质粒提取试剂盒(室温保存)。 7 现场检测 7.1 检查 对植物进行检查,注意植物地上部分是否有生长不良,叶色失绿、黄化,植株矮化等症状;块茎、鳞 茎、球根等是否有干腐、变黑等症状。收集上述有为害症状的可疑植物材料及其夹带的介质或土壤,做 好记录,写上标签,带回实验室检验。 7.2 抽样 应有针对性地抽取具有可疑症状的样品,分别用塑料袋装好,加贴标识;带回实验室后,打开袋口透 气,适当保温,放在20℃~25℃室内待检。 对于无可疑症状的样品则按要求随机抽样,具体抽样比例按照SN/T1157、SN/T1158和SN/T2122 中的规定进行抽样。 8 实验室检验 8.1 线虫分离 采用两种方法进行分离:浅盘分离法按照SN/T1141—2002中B.2中对对线虫分离的要求进行, 改进型漏斗法参见附录B。 8.2 标本制作 见SN/T1141—2002中的附录C。 8.3 显微观察、描述和测计 在显微镜下,对线虫进行形态观察、描述和测计。 8.4 分子生物学检测 对形态特征观察可疑的线虫进行双重PCR分子生物学检测(见附录C)。 2GB/T29577—2013 9 形态学鉴定 9.1 茎线虫属形态鉴定特征 9.1.1 总则 茎线虫属的雌虫和雄虫,其尾形非常相似,呈长圆锥形到近柱形,偶尔丝状,多数c’(尾长÷肛门或 泄殖腔处体宽)为4~7,寄主不形成虫瘿。 9.1.2 雌虫 9.1.2.1 体表特征 虫体一般较纤细,略弯曲,长0.6mm~1.5mm,表皮有很细的环纹,侧区有4~6条侧线。 9.1.2.2 内部特征 口针细小,多数长度为7μm~11μm;中食道球有或无瓣,偶尔无明显的中食道球,峡部与后食道 腺之间无缢缩,后食道腺短或长,不覆盖、短覆盖或长覆盖肠。 9.1.2.3 生殖系统特征 雌虫单生殖腺、前伸,卵巢短或长,有时伸达食道区或转折,卵母细胞一行至两行排列,子宫柱状部 有四排细胞(每排四个细胞)。有后阴子宫囊,且与虫体中线垂直。 9.1.3 雄虫 雄虫体表特征和消化系统特征与雌虫相似。雄虫精巢不转折,精细胞大(通常直径3μm~5μm), 交合伞延伸至尾长的1/4~3/4处,从不伸达尾顶端。交合刺窄细,基部宽大,其上具特殊的突起。 9.2 腐烂茎线虫形态鉴定特征 9.2.1 雌虫 9.2.1.1 体表特征 温热杀死固定后的虫体略呈弓形向腹弯曲,有细微的环纹,体宽约1μm,侧线六条,在虫体两端渐 减为两条;唇区低平,略缢缩,唇区框架进行程度较高,侧器孔位于侧唇片。 9.2.1.2 内部特征 口针长度常约为10μm~14μm,针锥常占口针长度的45%~50%;口针基部球清晰、圆形,前表面 向后斜。中食道球纺锤形,肌肉发达,有瓣,食道狭部窄,神经环包围处开始膨大为棒状的食道腺体;食 道腺延伸、从背面稍覆盖肠的前端一小段(偶尔缢缩);偶然亦能见到后食道腺分枝(叉)。排泄孔位于食 道腺位置;半月体刚好在排泄孔前方。 3GB/T29577—2013 9.2.1.3 生殖系统特征 阴门清晰、横裂,位于虫体后部,成熟雌虫的阴唇略隆起,阴门裂与体轴线垂直,阴门宽度占4个体 环。卵巢发达、前伸、达食道腺基部,前端卵原细胞双行排列。卵长椭圆形,长度约为体宽1.5倍。后阴 子宫囊大,延伸至肛阴距2/3~4/5。直肠和肛门明显,尾长约为肛门部体宽的3倍~5倍。尾锥形,稍 向腹部弯曲,末端窄圆。 9.2.2 雄虫 虫体比雌虫短而细,前部形态与雌虫相似,经热杀死后体直或向腹面弯曲成弓形。尾比雌虫的尾部 略窄,且末端尖圆;单精巢前伸,前端可达食道腺基部。泄殖腔隆起,交合伞起始于交合刺前端水平处, 向后延伸达尾长3/4;交合刺成对,长24μm~27μm,向腹面弯曲,前端膨大具指状突;引带短、简单。 9.3 腐烂茎线虫形态特征图 参见附录D。 9.4 测计值 表1列出了腐烂茎线虫雌虫和雄虫形态测计值。 表1 腐烂茎线虫形态测计值 数据来源L mma b c V TSt μmN 条 Thorne (1945)雌虫 0.81~1.4030~358~1015~2078~83 雄虫 0.80~1.3034~407~812~16 73~80 Goody (1952)雌虫 0.69~1.8919~494~129~3073~90 237 雄虫 0.76~1.3524~504~1111~21 40~84 231 Brzesk (1991)雌虫 0.69~1.8918~494~1214~2077~84 10~13 雄虫 0.63~1.3524~504~1111~21 10~12 注: N———测计的线虫样本数目; L———虫体体长(单位为μm或mm,头端至尾端的长度,不包括尾尖突); St———口针长度(单位为μm); a———体长/最大体宽; b———体长/虫体前端至食道腺与肠连接处的距离; c———体长/尾长; T———泄殖腔开口至精巢末端的距离×100/体长; V———虫体前端至阴门的距离×100/体长。 9.5 腐烂茎线虫与两种近似种的区别 表2列出了腐烂茎线虫与其他两种常见的茎线虫的形态区别对照。 4GB/T29577—2013 表2 茎线虫属三种常见线虫的主要形态区别对照表 项 目种 别 腐烂茎线虫 Ditylenchusdestructor鳞球茎茎线虫 D.dipsaci蘑菇茎线虫 D.myceliophagus 侵染部位 主要是地下部分,偶见地上部分 地上和地下部分 蘑菇菌丝 寄生专化性 高等植物和真菌 专性寄生高等植物 真菌 是否产生线虫毛 不产生 产生 不产生 侧线数目 6 4 6 食道与肠覆盖程度 覆盖