ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T29431—2012 番 茄溃疡病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofClavibactermichiganensissubsp. michiganensis(Smith)Davisetal. 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、华南农业大学、中国农业大学、中华人民 共和国北京出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:乐海洋、彭仁、刘琼光、罗来鑫、张建军、刘勇、冯欣、龚忠年、林友伟、张卫东、 高文娜。 ⅠGB/T29431—2012 番茄溃疡病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了番茄溃疡病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于番茄种子、苗木等相关茄科植物材料中番茄溃疡病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 番茄溃疡病菌基本信息 中文名:番茄溃疡病菌(密执安棒形杆菌密执安亚种)。 学名:Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis(Smith,1910)Davisetal.,1984,简称 Cmm)。 异名:CorynebacteriummichiganensepV.michiganense(Smith)Dye&Kemp;Corynebacterium michiganense(Smith)Jensen。 病害英文名:Bacterialcankeroftomato。 属细菌域Bacteria、放线菌门Actinobacteria、放线菌纲Actinobacteria、放线菌目Actinomvcetales、 微杆菌科Microbacteriaceae、棒形杆菌属Clavibacter。 该病原菌的远距离传播主要靠带菌种子,番茄种子内外层都可带菌。在田间和温室,该病菌由伤 口、气孔和自然孔口侵入寄主组织,主要通过灌溉水、雨水、修枝剪、培养料等传播。该病菌在土壤和病 残体组织中可存活2年~3年。 番茄溃疡病菌的其他基本信息参见附录A。 4 方法原理 根据番茄溃疡病菌的危害状,对检疫现场或田间病害调查中发现的疑似病害症状样品进行采集并 带回实验室作进一步分离鉴定,依据病原菌的培养性状、致病性反应以及分子生物学特征对种类进行 判定。 5 仪器和用具 生物显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、光照恒温培养箱、恒温振荡培养箱、电子天平、低温冰箱、接 种环、牙签、注射器、恒温水浴锅、高速冷冻离心机(12000r/min以上)、匀浆机、PCR仪、电泳装置(电 泳仪和水平电泳槽)、凝胶成像分析仪、微量可调加样器等。 1GB/T29431—2012 6 主要试剂 蔗糖、蛋白胨、酪蛋白水解物、酵母膏、葡萄糖、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、硫 酸镁(MgSO4·7H2O)、琼脂、萘啶酮酸钠、硫酸多粘菌素、放线菌酮、硼酸(H2BO3)、甘油、磷酸氢二钠 (Na2HPO4)、吐温-20(Tween-20)、硫代硫酸钠(Na2S2O3)、氯化铵(NH4Cl)、Trizma碱、烟酸、亚碲酸 钾、甘露糖、碳酸钙(CaCO3)、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸钠 (SDS)、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、琼脂糖(电泳用)、TaqDNA聚合酶、DNAMarker。 7 检测鉴定方法 7.1 现场检疫和抽样 番茄种植田间的病害调查或进出境番茄样品的现场检疫中,若番茄植株或果实病害症状表现与附 录A中描述类似,取样带回实验室作进一步分离鉴定;对番茄种子可进行种植观察或样品分离鉴定。 取样方法和步骤按照SN/T2122。 7.2 种植观察 将待测的番茄种子种植于温室或实验室的育苗钵(钵内土壤或基质应灭菌)中,每份种子样品种植 5000粒左右,最少不低于3000粒种子,生长环境温度24℃~34℃,相对湿度大于或等于70%,种子 出苗后15d内观察幼苗发病情况。如果种植期间有发病幼苗,且表现出番茄溃疡病苗期的典型症状 (参见附录A),则进一步采集可疑病株进行分离鉴定。 7.3 分离培养 7.3.1 种子中病原细菌的分离培养 7.3.1.1 种子细菌浸提液制备 将24g种子(至少12g)样品加入灭菌袋,加种子提取缓冲液(按1g种子加4mL提取缓冲液比 例),4℃培养过夜(最少14h),在匀浆机上至少浸7min。分离培养番茄溃疡病菌所用的缓冲液、培养 基配方见附录B。 7.3.1.2 半选择性培养基平板分离 用三层消毒纱布(或过滤袋)过滤种子浸提液,至少取2mL过滤提取液,8000g离心15min,仔细 除去上清液,沉淀用十分之一离心体积的无菌种子提取液悬浮,并用无菌种子提取液进行10倍梯度稀 释(稀释到100倍),取0.1mL每一稀释度分别涂布于D2ANX和SCM或mSCM半选择性培养基平 板。同时,用无菌种子提取缓冲液制备Cmm标准菌株10倍系列稀释液,取0.1mLCmm标准菌株的 每一个稀释浓度分别涂布于上述半选择性培养基平板上,以保证至少一个平板菌落数在50~200个范 围内。将培养皿于26℃~28℃培养,在5d、7d、10d各检查平板菌落生长情况。检查Cmm标准菌株 在两种培养基上生长情况和菌落形态特征。检查待测样品培养皿中是否有Cmm可疑菌落,与Cmm标 准菌株比较。记录可疑菌落和其他菌落数。 在D2ANX上培养5d~7d后,Cmm菌落黄色,黏液状,凸起。 在SCM上培养10d后,Cmm菌落灰白半透明,黏液状,最后为不规则型,中间内部有黑点(斑)。 在mSCM上培养10d后,Cmm菌落半透明米白,黏液状,最后为不规则型,中间内部带有黄色/橙 色点(斑)。 2GB/T29431—2012 菌落的大小和颜色在不同样品中可能存在差异。通常Cmm的形态和颜色在SCM和mSCM会发 生变化。如果存在菌落形态和颜色的变化,每批样品每个皿至少挑取5个可疑菌落在YDC培养基上做 进一步纯化培养观察。在YDC上,Cmm菌落黄色,圆形,凸起,黏液状,挑取具有这些特征的菌落,做 进一步的番茄致病性测定。注意在YDC上划线过程中,若菌落未分开,其菌落形态不一定总是圆形 的,如果存在这种情况,可挑取这些可疑菌落先进行紫茉莉(Mirabilisjalapa)接种检测,若测定为阳 性,则进一步在番茄上进行致病性测定,若测定为阴性,则表明为非Cmm细菌。 7.3.2 病组织中病原细菌的分离培养 用灭菌剪刀剪取病变组织(叶片、茎秆、果实)上的病斑,在70%酒精或含有效氯7%的次氯酸钠溶 液中表面消毒50s~60s,无菌水清洗3次,然后将其移至灭菌培养皿中,加5~10滴无菌水,用灭菌镊 子和剪刀将病组织捣碎,静置5min~10min,即制成组织液。用灭菌的接种环蘸一环组织液,在SCM 或mSCM培养基上划线,每处理重复3次,25℃~28℃下培养。Cmm在SCM或mSCM培养基上生 长较慢,在25℃~28℃下需培养7d~10d才可见典型浅黄色菌落;纯化或活化Cmm则用YDC培养 基为好,24h~48h内就可见典型金黄色菌落。挑取典型菌落,做进一步的番茄致病性测定。如果存在 与典型菌落有相似特征的可疑菌落,可挑取这些可疑菌落先进行紫茉莉接种检测,如果测定为阳性,则 进一步在番茄上进行致病性测定,如果测定为阴性,则表明为非Cmm细菌。 7.4 紫茉莉接种检测 供测试的菌株在YDC琼脂斜面上培养48h后,用无菌水洗下,调整悬浮液中细菌的浓度为 1×107CFU/mL。用一次性注射器注射接种紫茉莉叶片,同时接种标准菌株做阳性对照,接种无菌水 为阴性对照。接种后植株置于18℃~36℃环境下36h~48h,观察过敏性坏死现象。当用Cmm接种 后,紫茉莉的叶片在36h~48h内就能出现典型的过敏性坏死斑。其他棒状杆菌及常见植物病原细菌 均不能引起紫茉莉产生过敏性坏死反应。 7.5 番茄上致病性测定 感病番茄幼苗(如华南红宝石、佳粉10号、合作908等)在生长环境温度25℃~32℃,相对湿度≥ 70%条件下生长到2~3片真叶(大约播种后3周~4周),用灭菌牙签蘸取YDC平板上可疑菌落,在番 茄幼苗的子叶和第一片真叶之间茎的位置,穿刺法接种。同时接种标准菌株做阳性对照,无菌牙签蘸取 无菌水接种做阴性对照。接种后植株置于25℃~32℃条件至少8h光照培养,并适时浇水保持苗床 土壤湿润。接种后2周~3周,观察植株的萎蔫症状,与阳性对照进行比较并做好相关记录。由Cmm 引起的典型症状是在接种位置产生溃疡斑,变黄,边缘坏死,真叶萎蔫。 7.6 分子生物学检测 在上述检测和鉴定的基础上,可通过分子生物学检测进一步确定和验证。从分离培养的细菌菌株 中提取DNA(也可直接用菌液,浓度1×105CFU/mL),或从表现典型症状的病组织中提取DNA,作为 模板,进行PCR检测和电泳分析。用Cmm标准菌株DNA作为阳性对照,用非Cmm的植物病原细菌 DNA作为阴性对照,用双蒸水作空白对照,进行PCR扩增。具体检测方法见附录C。 8 结果判定 若经症状检验并分离的细菌菌株在半选择性培养基上的菌落特征