ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T29429—2012 草 莓角斑病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofXanthomonasfragariaeKennedy&King 2012-12-31发布 2013-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:刘天鸿、邵秀玲、赵文军、杨万风、厉艳、魏厚德、沙天慧、孟祥龙。 ⅠGB/T29429—2012 草莓角斑病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了草莓角斑病菌XanthomonasfragariaeKennedy&King的检疫鉴定以形态学特征、 生物学特征和PCR特异性反应为依据,明确了样品采集、病原菌分离、致病性测定、PCR反应、样品保 存的方法。 本标准适用于草莓种苗中草莓角斑病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T4789.28—2003 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 SN/T1157 进出境植物苗木检疫规程 3 草莓角斑病菌基本信息 中文名:草莓角斑病菌。 学名:XanthomonasfragariaeKennedy&King。 病害英文名:Angularleafspotofstrawberry。 属于原核生物界Procaryote,薄壁细菌门Gracilicutes,暗细菌纲Scotobacteria,假单胞杆菌科 Pseudomonadaceae,黄单胞杆菌属Xanthomonas。 该病菌可通过雨水和田间灌溉飞溅作局部传播、扩散,携带病菌的草莓苗以及夹杂在草莓苗中的病 残体都可能随贸易作短距离和长距离的运输传播。 草莓角斑病菌的其他信息参见附录A。 4 方法原理 根据草莓角斑病菌的危害症状采集样品,通过实验室分离、培养和致病性测定,以及分子生物学测 定等方法,依据病害的症状、病原菌的形态特征、生物学特性、生化特性、致病性测定,以及分子生物学特 征进行判定。 5 仪器和用具 生物显微镜、生化培养箱、高压灭菌器、电子天平(感量0.01mg)、恒温振荡培养箱、超净工作台、 PCR仪、电泳装置、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、移液器、移液器枪头、研钵、量筒、烧杯、培养皿、PCR 管、离心管、接种针、玻璃棒、剪刀等。 6 主要试剂 蛋白胨、酵母膏、蔗糖、葡萄糖、琼脂粉、冰乙酸、乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)、十六烷基三乙基溴化 1GB/T29429—2012 铵(CTAB)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸钠(SDS)、液氮、酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、琼 脂糖(电泳用)、溴化乙锭(EB)、TaqDNA聚合酶、氯化钾(KCl)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、氯化钠 (NaCl)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、氯化镁(MgCl2)、硫酸镁(MgSO4·7H2O)、硝酸钠(NaNO3)、乙二胺 四乙酸钠(Na2EDTA)、溴酚蓝、蛋白酶K、RNaseA、10×PCR缓冲液、dNTP(dATP、dTTP、dCTP、 dGTP)。 7 检疫鉴定方法 7.1 现场检疫 抽样数按SN/T1157中规定的方法进行。 在现场检疫时,应仔细检查草莓苗叶和茎有无病变症状,如在草莓叶面上发现水渍状红褐色不规则 形病斑、叶背溢出菌脓、植株生长点变黑等可疑症状时,应取样作实验室鉴定。 在产地检疫和隔离试种期间,还要注意检查有无淡红褐色干枯病叶或生长点死亡的植株,当发现可 疑症状应取样作实验室鉴定。 7.2 病原菌分离纯化 选取新发病的、带有水渍状病斑的病叶,用70%的乙醇进行表面消毒,切取病健交界处,无菌水冲 洗后碾碎,置于PBS缓冲溶液(参见附录B)中10min~15min。在无菌操作条件下吸取稀释液均匀涂 布于WILBRINK-N培养基(参见附录B)平板上,置于25℃培养5d~7d,然后再进行三次的纯化,最 后获得纯菌株。 7.3 病原菌形态观察及生理生化测定 7.3.1 形态观察 对分离纯化获得的纯菌株,经染色制成玻片,在显微镜下观察形状,测量大小。 7.3.2 菌落颜色 将菌株在WILBRINK-N或YPGA培养基(参见附录B)上划线培养,置于25℃培养5d~7d,观 察菌落的颜色和形状。 7.3.3 生理生化测定 该菌生理生化测定见附录C。 7.4 致病性测定 将WILBRINK-N或YPGA培养液(参见附录B)中培养3d~5d的菌株,用PBS缓冲溶液稀释到 109CFU/mL,选取完全健康的草莓感病品种,用蘸取悬浮液的接种针小心地扎刺新生叶面,每片叶扎 刺5~10次,最好不要扎穿叶子,设置五个重复,以PBS缓冲溶液为对照。接种后用塑料袋罩住植株, 使植株置于20℃~25℃、相对湿度≥80%的隔离温室里生长4周,每天观察并记录发病情况,出现症 状后,用7.2方法进行病原菌再分离、纯化。 7.5 PCR法检测 该检测方法见附录D。 2GB/T29429—2012 8 鉴定特征 8.1 症状特征 草莓角斑病菌初侵染时在叶片下表面出现1mm~4mm大小的水渍状红褐色不规则形病斑,病斑 扩大时受细小叶脉所限呈角形叶斑。病斑在可见光下呈透明状,在反射光下呈暗绿色。病斑逐渐扩大 后融合成一体,渐变淡红褐色而干枯。湿度大时叶背可见溢出菌脓,干燥条件下成一薄膜。病斑常在叶 尖或叶缘处,严重时使植株生长点变黑枯死,叶片发病后常干缩破碎形成孔洞。在适宜的条件下,花萼 也能受侵染。另外,该细菌还可导致维管束病变。 8.2 病原特征 无荚膜杆菌,单个、成双或成短链,具单根极鞭,革兰氏染色阴性,大小约为0.4μm×1.3μm。病 菌生长较慢,在培养基上4d~5d才能形成菌落。营养琼脂上,菌落圆屋顶形,边缘整齐规则,有光泽, 黄色奶油状。好氧菌,氯化钠最大耐受力为0.5%~1.0%,生长最适温度25℃,超过33℃不能生长。 明胶液化、淀粉水解,不水解七叶苷,不从阿拉伯糖、半乳糖、海藻糖、纤维二糖溶液产酸,不能利用天冬 酰胺作唯一碳源和氮源。 8.3 致病性特征 针刺接种后,在7d左右应出现水渍状红褐色病斑,这些病斑逐渐扩大坏死,经病原菌再分离获得 的纯菌株应具有与原菌株一致的病原特征。而所设的阴性对照并没有出现相应症状。 8.4 分子生物学特征 测试菌株经PCR反应后,如果PCR产物与阳性对照条带一致(537bp),且阴性对照和空白对照均 没有相应条带,则能证明所测菌株为阳性。否则,则判断为阴性。 9 结果评定 根据草莓角斑病菌的鉴定特征(见第8章)进行综合判定,凡症状、病原特征、生理生化特性、致病性 特征以及分子生物学特征与第8章描述相符,可以判定为草莓角斑病菌,否则结果判定为不是。 10 样品保存 经检疫鉴定后,应妥善保存样品及菌株,以备复验、谈判和仲裁。保存期满,需经灭菌后方可处理。 11 菌株保存 从检测样品中分离到并鉴定为草莓角斑病菌的菌株,应妥善保存。将菌株转接到WILBRINK-N 或YPGA培养基斜面上,25℃恒温培养5d~7d。然后置于4℃冰箱中保存,定期(30d~60d)转接, 防止病菌死亡;必要时将菌株用真空冷冻干燥机制成冻干粉,-80℃下长期保存。 3GB/T29429—2012 附 录 A (资料性附录) 草莓角斑病菌的相关资料 A.1 分布 以色列、中国台湾、比利时、法国、希腊、意大利、葡萄牙、罗马尼亚、西班牙、瑞士、埃塞俄比亚、留尼 旺、澳大利亚、新西兰、美国(加利福尼亚州、佛罗里达州、肯塔基州、明尼苏达州、威斯康星州)、阿根廷、 巴西、智利、厄瓜多尔、乌拉圭、委内瑞拉。 A.2 寄主范围 草莓(Fragariaananassa)是该病原菌的主要寄主。病原菌对草莓属(Fragaria)的其他品种的致 病性变化较大。人工接种情况下,弗州草莓(F.virginiana)、野草莓(F.vesca)、金露梅(Potentilla fruticosa)和委陵菜(P.glandulosa)均可被草莓角斑病菌侵染。草莓属植物中仅麝香草莓(F. moschata)对草莓角斑病菌免疫。 A.3 生物学特性 病叶残渣和带菌植株是发病的初次侵染源。在病残叶和土壤中,病菌能够存活到下茬作物;在实验 室保存的干燥病叶片中,病原菌至少可存活两年半。在草莓开始生长时,病原菌由病残叶传播到幼叶 上,细菌可从侵染区沿着幼叶基部叶脉扩散,在田间传播主要靠雨水、喷灌及风的作用传播。病原菌可 通过气孔侵入,也可经过局部伤口或下方的病叶侵染,在整个生长期发生多个侵染循环,病菌可侵染植 物的花,但不侵染果实。中等偏低的日温(大约20℃)、夜间低温及较高的湿度更有利于该病菌的侵染。 4GB/T29429—2012 附 录 B (资料性附录) 草莓角斑病菌常用培养基、缓冲液配方 B.1 WILBRINK-N培养基 蔗糖10.0g/L,蛋白胨5.0g/L,磷酸氢二钾0.5g/L,硫酸镁0.25g/L,硝酸钠0.25g/L,琼脂 15.0g/L,pH7.2。 B.2 WILBRINK-N培养液 蔗糖10.0g/L,蛋白胨5.0g/L,磷酸氢二钾0.5g/L,硫酸镁0.25g/L,硝酸钠0.25g/L,pH7