ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T29397—2012 香 蕉枯萎病菌4号小种检疫检测与鉴定 DetectionandidentificationofFusariumoxysporum f.sp.Cubense(E.F.Smith)Snyder&HansenRace4 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:全国农业技术推广服务中心、广东省植物检疫站、华南农业大学。 本标准主要起草人:王玉玺、王琳、吴立峰、姜子德、李敏慧、任小平、李小妮、吴仕豪。 ⅠGB/T29397—2012 香蕉枯萎病菌4号小种检疫检测与鉴定 1 范围 本标准规定了香蕉枯萎病菌4号小种[Fusariumoxysporumf.sp.Cubense(E.F.Smith)Snyder& HansenRace4]的现场检验和实验室检测鉴定以香蕉枯萎病菌4号小种的为害症状、病原菌形态、致病 性测定结果、Komada改良培养基上的菌落性状和寄主范围为依据,明确了现场查验、实验室鉴定、菌种 保存的方法。 本标准适用于香蕉(包括香蕉、大蕉、粉蕉等香蕉枯萎病菌4号小种易感品种)生长期间的香蕉枯萎 病菌4号小种的检测。 2 原理 根据香蕉枯萎病菌4号小种的为害症状,取病健部交界组织分离培养病原菌,根据病原菌形态、致 病性测定结果、疑似病菌在Komada改良培养基上的菌落性状进行判定。 3 仪器、用具及药品 3.1 仪器、用具 仪器:超净工作台、培养箱、光学显微镜、高压灭菌、照相机等。 用具:铲、枝剪、砍刀、纸袋、油性笔、记录本、标签纸、小刀片、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、挑针、酒 精灯等。 3.2 药品 0.1%升汞、70%乙醇、无水乙醇、灭菌水、去离子水、40%甘油、磷酸氢二钾、氯化钾、7水硫酸镁、乙 二胺四乙酸铁钠、L-天门冬酰胺、半乳糖、琼脂粉、75%五氯硝苯可湿性粉剂、牛胆粉、硼砂、硫酸链霉素、 10%磷酸等。 4 现场查验 4.1 现场调查 4.1.1 调查范围 香蕉种植地及香蕉试管苗二级苗生产和销售场地。 4.1.2 调查方法 对香蕉枯萎病菌4号小种的寄主植物进行踏查,观察其生长状况;向香蕉种植者和管理人员询问, 确定疑似香蕉枯萎病菌4号小种为害的田块,对疑似田块进行现场检验。 4.1.3 症状识别 对地上部表现症状的植株,剖开其根部和假茎部维管束组织,观察是否发生颜色变化。 1GB/T29397—2012 对地上部无明显症状的植株,随机抽取部分植株,观察其根部及假茎部位维管束组织是否发生颜色 变化。 症状表现参见附录A。 4.2 样本的采集 采样前需对取样现场及病害症状拍照。 疑似病株的取样应选取症状典型、中等发病程度的植株,取样部位包括蕉头病健部交界组织 (8cm×8cm)、根、假茎(长20cm)、叶柄;对二级苗应取整个植株,所有样品采用坚韧纸质材料包裹,切 勿采用塑料薄膜包裹。样品应附上采集时间、地点、品种的记录和田间照片。采样后填写附录B。 5 实验室检测鉴定 5.1 病原菌的分离与培养 取病健部交界组织,切成小块(2mm×3mm),将小块组织先放于70%乙醇溶液中浸5s、再转入 0.1%升汞溶液中浸泡1min~2min进行消毒处理,然后用灭菌水漂洗3次;将消毒处理和漂洗后的小 块组织置于PDA或PSA平板上恒温(25℃)培养,菌落白色絮状,基质淡紫或淡紫红色;培养5d~7d 可产生大量小型分生孢子,培养10d~15d可产生少量大型分生孢子,培养30d后有厚垣孢子形成。 结果符合附录A形态描述的,可继续按5.2的方法进行病原菌致病性测定。 5.2 病原菌致病性测定 采用伤根浸菌接种法。将4~5叶期健康组培香蕉苗(巴西蕉或广东香蕉2号)自沙床中拔出,然后 用缓慢流出的自来水冲洗根部以去除附在其根上的沙子,再分别浸在配制好的各分离菌株孢子悬浮液 中(孢子浓度不低于1×105个/mL),以清水做对照,30min后移栽到盛有灭菌细沙的营养杯,置于温室 (25℃~32℃),15d~20d后观察结果。罹病蕉苗如表现出附录A的症状。对病株进行组织分离,应 得到与原接种菌相同培养性状和形态特征的病原菌。按照柯赫氏法则,可初步确定该病原菌为尖孢镰 刀菌古巴专化型4号小种。 5.3 在Komada改良培养基上的菌落性状 5.3.1 Komada改良培养基的配制 融化900mL基本培养基[磷酸氢二钾,1g;氯化钾,0.5g;硫酸镁,0.5g;乙二胺四乙酸铁钠, 0.01g;L-天门冬酰胺,2g;半乳糖,10g;琼脂粉,16g;去离子水定容至900mL,高压灭菌],在无菌操 作下与100mL的盐溶液(5%五氯硝苯可湿性粉剂,0.9g;牛胆粉,0.45g;硼砂,0.5g;硫酸链霉素, 0.3g;用10%磷酸调pH值到3.8±0.2)混合,倒平板。 5.3.2 Komada改良培养基上菌落特征 将经5.1测定的疑似病菌的单孢分离菌株接于Komada改良培养基平板上,25℃、40W普通日光 灯相距约30cm照射下培养10d后观察菌落性状,4号小种的菌落边缘为裂齿状,而1号小种及其他的 2GB/T29397—2012 镰刀菌的菌落边缘则平滑,如图1。 图1 1号和4号小种在Komada改良培养基上的菌落形态(左图为4号小种,右图为1号小种。) 6 结果判定 根据病原菌的形态学、致病性测定,及疑似病菌在Komada改良培养基上菌落边缘出现齿状的特 征,按照柯赫氏法则可确定该病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种。 将实验室检测鉴定结果填入《植物有害生物样本鉴定报告》(见附录C)。 7 菌种的保存 对判定为香蕉枯萎病菌4号小种的菌株进行标注,包括菌株来源、寄主的品系、采集时间、采集人和 鉴定人,并将菌株移至40%甘油管保存在-80℃冰箱;或将菌株培养在试管斜面上,长满后存于4℃ 冰箱。 3GB/T29397—2012 附 录 A (资料性附录) 香蕉枯萎病菌基本信息 A.1 分类 香蕉枯萎病菌Fusariumoxysporunf.sp.Cubense(E.F.Smith)Snyder&Hansen隶属半知菌门 Deuteromycotina、丝孢纲Hyphomycetes、瘤座菌目Tuberculariales,镰刀菌属Fusarium,尖孢镰刀菌 古巴专化型Fusariumoxysporiumf.sp.Cubense。至今共发现有4个生理小种,其中4号小种是1967 年首先在我国台湾省报道的一个小种,能侵染“大蜜啥”、矮香蕉DwarfCavendish(AAA)、台湾拉屯旦 TaiwanLatundan(AAB)、PisangLilin(AA)、棱香蕉和野蕉(BB),尤其能侵染较抗病的香牙蕉 Cavendish(AAA),毁灭性最大。 A.2 为害症状 A.2.1 外部症状 该病菌侵染香蕉根系和球茎,堵塞输导组织,使罹病植株表现黄叶症状。植株感病早期无明显外部 症状,染病一段时间后,病害先从下部较老的叶片开始发生,发病初期叶片边缘变黄并逐渐扩展至主脉, 病叶叶柄在靠近叶鞘处容易折曲、下垂,后期病叶凋萎后倒挂在假茎旁,直至全株枯死;有时假茎基部开 裂。若是假植的组培苗染病,其叶片褪绿、无光泽,呈黄绿色或局部甚至整叶黄化;严重时整个假茎全部 变为褐色,部分根变褐腐烂。 A.2.2 内部症状 横切罹病香蕉植株的球茎部,可见维管束组织变成红褐色或暗褐色。纵剖病株球茎,可看到红褐色 至暗褐色病变的维管束成线条状,近茎基部颜色深,病变一直延伸到球茎部,根系变黑褐色而干枯。若 为假植组培苗,纵剖罹病小苗的假茎则可见褐色至红褐色的坏死斑点。 A.3 病原菌形态(引自NelsonP.E,etal,1983) 香蕉枯萎病菌可产生3种形态的无性分生孢子———大孢子,小孢子,厚垣孢子。大孢子镰刀形或纺 锤形,具3~5个隔膜,顶端细胞呈尖刀状或钩状,脚细胞明显,壁薄,(22μm~36μm)× (4μm~5μm);小孢子生于瓶梗状的产孢细胞上,圆形或椭圆形至肾形,具0~1个隔膜,壁薄, (5μm~7μm)×(2.5μm~3μm),在人工培养基上很容易见到。厚垣孢子圆形,壁厚,间生或顶生于 菌丝上,多单生,9μm×7μm,可在土壤中存活达3年~5年(见图A.1)。至今未发现有性态。 4GB/T29397—2012 图A.1 香蕉枯萎病菌的显微形态图(引自PloetzRC.2005a) 5GB/T29397—2012 附 录 B (规范性附录) 香蕉枯萎病菌4号小种调查取样记录表 表B.1 香蕉枯萎病菌4号小种调查取样记录表 编号: 生产/经营者 地址及邮编 联系/负责人 联系电话 调查日期 抽样地点 样品 编号植物名称(中文名和学名)品种 名称植物生育期 调查代表株数或面积 植物来源 症状描述: 发生与防控情况及原因: 抽样方法、部位和抽样比例 备注: 抽样单位(盖章): 抽样人(签名): 年 月 日生产/经营者 现场负责人 年 月 日 注:本表一式两份,抽样单位和受检单位各一份。 6GB/T29397—2012