ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T29396—2012 水 稻细菌性谷枯病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofBurkholderiaglumae(Kurita&Tabei)Urakamietal. 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国湖南出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国深圳出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:朱金国、莫瑾、朱水芳、赵文军、李芳荣、李一农、彭梓、钟文英。 ⅠGB/T29396—2012 水稻细菌性谷枯病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了水稻种子和其他水稻材料的水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderiaglumae)的检疫鉴 定以植物的形态学特征、生理生化特性、分子生物学和酶联免疫学技术作为依据,明确了田间观察、分离 鉴定、样品保存的方法。 本标准适用于水稻材料和相关环境中水稻细菌性谷枯病菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB15569—1995 农业植物调运检疫规程 国际种子检验规程(ISTA) 3 水稻细菌性谷枯病菌基本信息 中文名:水稻细菌性谷枯病菌(颖壳伯克氏菌;颖壳假单胞菌)。 学名:Burkholderiaglumae(Kurita&Tabei)Urakamieta1.。 异名:PseudomonasglumaeKurita&Tabei。 病害英文名:Bacterialgrainrotofrice。 属细菌界Bacteria、变形菌门Proteobacteria、乙型变形菌纲Betaproteobacteria、伯克氏菌目Burk- holderiales、伯克氏菌科Burkhoideriaceae、伯克霍尔德氏菌属Burkholderia。 种子带菌是远距离传播的主要途径。 水稻细菌性谷枯病菌的其他信息参见附录A。 4 方法原理 根据水稻植株的形态学特征进行田间观察,并采用分离培养、分子生物学和酶联免疫学筛选、生理 生化鉴定以及致病性测定对植株材料上的水稻细菌性谷枯病菌进行判定。 5 设备和材料 5.1 冷冻高速离心机:转速≤15000r/min。 5.2 PCR扩增仪。 5.3 恒温培养箱:28℃±1℃。 5.4 显微镜:物镜头10×~100×。 5.5 天平:精度0.001g。 5.6 高压灭菌器。 1GB/T29396—2012 5.7 冰箱:0℃~4℃。 5.8 均质器:转速4000r/min~8000r/min。 5.9 可调移液器:10μL~100μL,100μL~1000μL。 5.10 器具:灭菌的镊子、剪刀、称量勺。 5.11 吸管:1mL、10mL。 5.12 灭菌平皿:直径90mm,玻璃或一次性塑料平皿。 5.13 三角瓶:100mL。 6 培养基和试剂 6.1 S-PG培养基:见B.1。 6.2 CCNT培养基:见B.2。 6.3 SPA培养基:见B.3。 6.4 0.001%吐温20-磷酸盐缓冲液:见B.4。 6.5 革兰氏染色试剂:见B.5。 6.6 鞭毛染色试剂:见B.6。 6.7 明胶液化培养基:见B.7。 6.8 氧化酶试剂:见B.8。 6.9 硝酸盐培养基:见B.9。 6.10 过氧化氢酶试验试剂:见B.10。 6.11 O-F葡萄糖利用培养基:见B.11。 6.12 葡萄糖酸盐培养基:见B.12。 6.13 精氨酸双水解酶试验用培养基(AD):见B.13。 6.14 淀粉水解培养基:见B.14。 6.15 糖利用培养基:见B.15。 7 田间检验 水稻细菌性谷枯病在水稻抽穗期至灌浆期的谷粒和植株上均可显现明显症状,通过田间观察可直 接对水稻受害情况进行判断,该病害田间症状及相关资料参见附录A。对田间检验有病害发生的植株, 按以下操作进行抽样及实验室检验。 8 抽样 水稻种子抽样可参照ISTA《国际种子检验规程》或者GB15569—1995中6.1方法进行。 9 样品处理及分离培养 9.1 水稻种子 大量种子样品先用蒸馏水冲洗后,称取10g或400粒种子放入90mL0.001%吐温-磷酸盐缓冲液 (pH7.0)中低温(5℃~15℃)浸泡4h~6h,用均质器打碎,制备样品提取液。如果是检测少量的种 子样品,取20粒种子加入10mL灭菌的0.001%吐温-磷酸盐缓冲液(pH7.0),用灭菌槌和研钵或是搅 拌器将种子充分碾磨,制成提取液。 2GB/T29396—2012 将样品提取液置于22℃~25℃环境中4h~6h后,旋涡混匀悬浮液5min,悬浮液进行十倍梯度 稀释,稀释后的10×,和100×以及1000×三个稀释度的悬浮液取0.3mL,分别放入到3个S-PG和 CCNT的平皿中(每个平皿加0.1mL)。用L-型玻璃棒将液体均匀涂布在琼脂的表面。 9.2 植物组织材料 9.2.1 无症状组织 将10g左右样品直接放入90mL0.001%吐温-磷酸盐缓冲液中,均质1min制备成样品提取液。 按6.1方法进行稀释与涂布。 9.2.2 未显症状的可疑组织 用灭菌的剪刀剪成2mm×7mm大小的小块,放入S-PG和CCNT平板中,滴入2~3滴(约 0.2mL)的生理盐水,放置5min~10min,让细菌从这些组织中渗出。 9.2.3 有明显症状的叶片 从叶片损伤部位的前端切下2mm×7mm片段。将其放入70%的乙醇中15s~30s,消毒叶片组 织。在试管中用灭菌蒸馏水清洗叶片2~3次后放入S-PG和CCNT平板上。 10 培养分离 接种后的平皿28℃±1℃培养3d后观察生长菌落形态,细菌性谷枯病菌在S-PG上呈现两种生 长形态,一种菌落为红褐色、圆形、光滑、隆起;另一种菌落为淡紫色、圆形、光滑、隆起。细菌性谷枯病菌 在CCNT上产生带有黄色扩散性色素的白色菌落。 用接种环从平板中挑选5个以上生长典型或疑似菌落,接种到改良SPA蛋白胨培养基培养纯化, 以进行进一步生化鉴定试验,也可以采用BIOLOG微生物鉴定系统进行鉴定。对疑似菌落也可以采用 PCR方法进行初筛,或者采用水稻细菌性谷枯病菌的ELISA试剂盒进行初步筛选(具体检测方法参照 试剂盒说明手册),阳性结果再继续通过生化鉴定做进一步证实。 11 PCR筛选试验 从分离培养的细菌菌株中提取DNA作为模板,进行PCR检测和电泳分析。用水稻细菌性谷枯病 标准菌株基因组DNA作为阳性对照,用不含有水稻细菌性谷枯菌株的植物组织材料或其他植物病原 菌基因组DNA为阴性对照,用双蒸水作空白对照,进行PCR扩增。将扩增产物进行琼脂糖电泳分析。 将分离得到的可疑菌落接种SPA斜面.培养24h~48h后用无菌水洗下斜面上生长的菌苔,制成 菌悬液。使用制备好的菌悬液进行分子生物学鉴定,具体操作过程见附录C。若测试菌株的PCR产物 与阳性对照分子量一致,继续进行生化鉴定试验。 12 生理生化鉴定 12.1 初步鉴定 挑取分离培养得到的符合特征的典型或可疑菌落分别进行氧化酶试验、过氧化氢酶试验、革兰氏染 色和鞭毛染色观察。氧化酶阴性,过氧化氢酶阳性,革兰氏染色阴性,极生一至多条鞭毛,大小为 (0.5μm~0.7μm)×(1.5μm~2.5μm),符合以上试验结果的菌落需进行以下生化鉴定实验(水稻细 3GB/T29396—2012 菌性谷枯病菌生化鉴定原理及相关资料参见附录A)。 12.2 硝酸盐还原试验 28℃±1℃培养48h后的菌悬液中加入硝酸盐还原试剂,观察颜色反应,细菌性谷枯病菌能将硝 酸盐还原成亚硝酸盐,颜色变红。 12.3 明胶液化 挑取纯化后菌落穿刺接种琼脂培养物后,28℃±1℃培养48h后,观察结果,细菌性谷枯病菌能水 解明胶。 12.4 O-F试验 以接种针挑取小量纯培养物做穿刺接种,同时接种两管O-F葡萄糖利用培养基,其中一支接种后 滴加灭菌石蜡于表面,于28℃±1℃培养48h后,判定结果。水稻细菌性谷枯病菌属于氧化型,在开 口管中产酸培养基变黄色,在封口管中不产酸培养基不变色。 12.5 产荧光素试验 挑取菌落划线于金氏B培养基,28℃±1℃培养72h后,在紫外灯下观察,细菌性谷枯病菌为不产 荧光的阴性反应。 12.6 精氨酸双水解酶试验 挑取菌落划线接种到精氨酸实验用培养基中,28℃±1℃培养48h后观察培养基颜色变化。细菌 性谷枯病菌呈阴性反应,培养基变成黄色。 12.7 葡萄糖酸盐氧化试验 较大量地接种菌落于葡萄糖酸盐培养基中,于28℃±1℃培养48h,加Benedict氏定性试剂 1mL,充分摇匀,置沸水中加热10min,待15min~30min,出现黄色~茶色~橙红色沉淀为阳性反应, 仍保持蓝或蓝绿色为阴性。水稻细菌性谷枯病菌为阴性反应。 12.8 淀粉水解试验 挑取菌落点接种于淀粉琼脂平板,于28℃±1℃培养48h后,滴浸试剂于培养物表面。即刻观察 结果。阳性反应为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环,阴性反应则整个平板呈深 蓝色,菌落或培养物周围无透明环。水稻细菌性谷枯病菌可水解淀粉,呈阳性反应。 12.9 海藻糖利用试验 挑取纯培养菌落穿刺接种于海藻糖半固体培养基,置28℃±1℃培养1d~2d,观察培养基有无 颜色变化