ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T29394—2012 柑 桔溃疡病菌的检疫检测与鉴定 DetectionandidentificationofXanthomonasaxonopodispv.Citri 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:全国农业技术推广服务中心、四川省植物检疫站、重庆大学。 本标准主要起草人:王福祥、宁红、谭家兴、项宇、郭迪金、王中康。 ⅠGB/T29394—2012 柑桔溃疡病菌的检疫检测与鉴定 1 范围 本标准规定了柑桔溃疡病菌(Xanthomonasaxonopodispv.Citri)的田间症状和实验室病原形态 鉴定、免疫学和PCR检验的技术要求。 本标准适用于芸香科植物检疫中柑桔溃疡病菌的检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T5040—2003 柑桔苗木产地检疫规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 显症植株 diseasedplant 受柑桔溃疡病菌侵染,并已经表现症状的寄主植物。 3.2 无症带菌植株 asymptomaticplant 受柑桔溃疡病菌侵染,但并没有表现症状的寄主植物。 3.3 疑似症状 suspiciouslesion 部分符合柑桔溃疡病典型症状描述或与典型症状描述相近似的症状。 4 柑桔溃疡病菌基本信息 中文名:柑桔溃疡病菌。 学名:Xanthomonasaxonopodispv.CitriVauterinetal1995。 异名:X.campestrispv.Citri(Hasse)Dye1978。 病害英文名:citruscanker,Bacterialcankerofcitrus。 属于黄单孢杆菌科,黄单孢杆菌属。 柑桔溃疡病远距离传播主要是通过人为的引种,商品的流通。带病苗木、接穗和果实等繁殖材料是 该病传播的载体。田间传播则是通过风雨、昆虫和农事操作等。 柑桔溃疡病菌的相关资料参见附录A。 5 方法原理 对于已形成柑桔溃疡病典型症状样品,由于典型症状易识别,且近似症状的病原菌为真菌(参见附 1GB/T29394—2012 录B),通过菌溢检查和革兰氏染色法,可直接进行鉴定;对于有疑似症状的样品,通过病原分离培养和 接种试验可进行检验鉴定;间接ELISA检验主要用于疑似症状、不显症样品的检验鉴定;PCR检验主 要用于以上两种方法均不能确定时的检验鉴定,有条件的实验室也可直接用于疑似症状、不显症植株的 检验鉴定。 6 仪器及用具 6.1 症状及病原形态鉴定仪器及用具 天平、高压灭菌锅、超净工作台、培养箱、生物显微镜、体式显微镜、解剖刀、接种棒、培养皿、烧杯、载 玻片、盖玻片、吸管等。 6.2 ELISA检测仪器及用具 天平、高速台式离心机、打孔器、微量移液器一套、移液器、酶标板、酶标仪等。 6.3 PCR检测仪器及用具 高速台式离心机、PCR扩增仪、PCR反应管、水平电泳仪、凝胶成像系统、微量移液器一套。 7 试剂及材料 除非另有说明,在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 7.1 症状及病原形态检测试剂与材料 7.1.1 无菌水H2O。 7.1.2 革兰氏染色液。 7.1.3 蔗糖蛋白胨培养基PSA。 7.2 ELISA检验试剂与材料 7.2.1 样品提取液:取1.15g磷酸氢二钠(Na2HPO4)、0.2g氯化钾(KCl)、0.2g磷酸二氢钾(KH2PO4)、8g 氯化钠(NaCl)、0.2g叠氮化钠(NaN3),用1000mL蒸馏水溶解,并调整pH值到7.4。 7.2.2 洗涤液:取1.15g磷酸氢二钠(Na2HPO4)、0.2g氯化钾(KCl)、0.2g磷酸二氢钾(KH2PO4)、 8g氯化钠(NaCl)、0.5g吐温-20,用1000mL蒸馏水溶解,并调整pH值到7.4。 7.2.3 封闭液:取5g无脂奶粉,用100mL样品提取液溶解。 7.2.4 包被液:取2.93g碳酸氢钠(Na2HCO3)、1.59g氯化钠(NaCl)、0.2g叠氮化钠(NaN3),用 1000mL蒸馏水溶解,并调pH值到9.6。 7.2.5 抗体稀释液:取2.5g脱脂奶粉、加100mL洗涤液溶解。 7.2.6 抗体:兔抗柑桔溃疡病菌抗体球蛋白。 7.2.7 酶标抗体:市售碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体球蛋白。 7.2.8 底物缓冲液:用80mL灭菌蒸馏水将0.01g氯化镁(MgCl2·6H2O)、0.02g叠氮化钠 (NaN3)、9.7mL二己醇胺(CH2CH2OH)溶解后,调pH值到9.8,定容到100mL。 7.2.9 底物溶液:将5mg对硝基苯磷酸盐(C6H5NO3)溶解于5mL底物缓冲液中。底物溶液制备需 在孵育结束前10min内,避光条件下制备。 7.2.10 终止液:将12g氢氧化钠(NaOH),用100mL蒸馏水溶解。 2GB/T29394—2012 7.3 PCR检验试剂与材料 7.3.1 灭菌超纯水ddH2O。 7.3.2 PCR缓冲液[×10]。 7.3.3 引物(primer): 上游引物(XAcF):5’-ACGAGAAAGAACTTCGCCCC-3’; 下游引物(XAcR):5’-TCTGACCACATCGCATAGGA-3’;用双蒸水稀释至50μmol/L。 7.3.4 dNTP[25mmol/L]。 7.3.5 MgCl2[25mmol/L]。 7.3.6 Taq酶[5u/μL]。 7.3.7 Marker:100bpDNAladder(≤1500bp)。 7.3.8 制样液:含0.3%亚硫酸钠(Na2SO3)的水溶液。 7.3.9 电泳缓冲液TBE[5×]:在1L水中加入Tris碱54g,硼酸27.5g,20mL0.5mol/LEDTA (pH8.0),使用时稀释为1×TBE工作液。 7.3.10 琼脂糖凝胶[2%]:在1×TBE工作液中加入2%的琼脂糖,融化后在每100mL琼脂糖溶液中 加入市售5μLDNA荧光染料(GoldView),冷却至60℃倒入插入梳子的制胶槽中,冷却凝固后点样 电泳。 7.3.11 样品缓冲液LoadingBuffer。 8 方法 8.1 症状及病原形态鉴定 8.1.1 症状识别 在寄主植物特别是柑桔类植物生长期,按GB/T5040—2003中第5章的要求,对苗圃和果园逐园、 逐株进行田间症状目测踏查。按要求采集有典型症状和疑似症状的柑桔溃疡病样本进行室内检验鉴 定。柑桔溃疡病典型症状参见附录B。 调运检疫和市场检疫发现符合附录B描述典型症状和疑似症状的寄主样本,取样送实验室检验。 8.1.2 菌溢检查 切取具有典型症状和疑似症状病斑的病健交界处小块组织,平放在载玻片上的水滴中,加盖玻片在 低倍显微镜下检查,观察有无菌溢现象。如果有菌溢出现,再进行革兰氏染色。 8.1.3 革兰氏染色 检查到菌溢的载玻片将植物组织移去,水滴干燥后通过火焰固定,再用革兰氏染色法染色,观察染 色反应。 8.1.4 分离培养鉴定 田间或其他检疫过程中取回的具有柑桔溃疡病疑似症状的样品,在无菌条件下取病健交界处组织 约(2mm~3mm)×(2mm~3mm),经表面消毒后放入0.2mL无菌水中,用灭菌玻璃棒捣碎,在室温 下浸泡5min~10min,将悬浮液在蔗糖蛋白胨培养基上划线,28℃培养2d~4d,观察病原菌形态特 征和培养特性,柑桔溃疡病菌形态特征和培养特性见附录C。 3GB/T29394—2012 8.1.5 致病性鉴定 将分离培养得到的纯培养菌株,用针刺涂抹法接种到健康的甜橙类柑桔新梢叶片上,在温度28℃ ~30℃、相对湿度95%~100%的条件下培养7d~10d,参见附录B观察发病症状。 8.2 间接ELISA检验 8.2.1 取样 疑似样品直接取样检验,无症样品田间取样方法见附录D。 8.2.2 程序 柑桔溃疡病菌间接ELISA检验程序见附录E。 8.3 PCR检验 8.3.1 取样 疑似样品直接取样检验,无症样品田间取样方法见附录D。 8.3.2 程序 柑桔溃疡病菌PCR检验程序见附录F。 9 结果判定 9.1 症状及病原形态鉴定 田间症状符合附录B描述的柑桔溃疡病典型症状特征,解剖镜检有菌溢现象,革兰氏染色呈阴性, 病原菌为柑桔溃疡病菌。如不能确定,进一步进行分离培养,分离培养物形态特征和培养特性同附录 C,致病性鉴定产生典型症状,病原菌为柑桔溃疡病菌。 9.2 间接ELISA检验 9.2.1 目测观察 在阳性对照反应孔为桔黄色、阴性对照反应孔无色的前提下,样品反应孔中三个重复均显示为黄 色,样品为阳性,即带有柑桔溃疡病菌;样品反应孔没有颜色变化,样品为阴性,即不带柑桔溃疡病菌。 9.2.2 用酶标仪测定光密度值 在阴性对照反应孔的光密度值(OD)≤0.1、阳性对照反应孔OD值大于厂家设定阳性OD值的前 提下,样品反应孔OD值大于阴性对照孔OD值的2倍,判定为阳性反应,即样品带柑桔溃疡病菌;否则 判定为阴性,即样品不带柑桔溃疡病菌。 9.3 PCR检验 在阴性对照无扩增条带、阳性对照出现一条278bp特异性条带的前提下,供试样品出现与阳性对 照相同大小的特异性扩增条带,样品判定为阳性,即