ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T29393—2012 柑 桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定 DetectionandidentificationofCandidatusliberobacterasiaticum 2012-12-31发布 2013-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:全国农业技术推广服务中心、浙江省植物保护检疫局。 本标准主要起草人:吴立峰、严铁、林云彪、项宇、朱景全、朱莉。 ⅠGB/T29393—2012 柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定 1 范围 本标准规定了柑桔黄龙病菌亚洲种Candidatusliberobacterasiaticumjagoueixetal.的检测与鉴 定方法。 本标准适用于植物检疫过程中对柑桔黄龙病菌亚洲种的检测与鉴定。 2 病菌基本信息 中文名:柑桔黄龙病菌。 学名:Candidatusliberobacterasiaticumjagoueixetal. 病害英文名:CitrusHuanglongbingHLB。 属薄壁菌门Gracilicutes、韧皮部杆菌属 Liberobacter。 3 方法原理 根据柑桔黄龙病菌侵染柑桔植株发病典型症状进行田间鉴定;经嫁接或经柑桔木虱(Diaphorina citri)传病后,可根据木本指示植物发病症状鉴定;聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)检 测技术对柑桔黄龙病菌DNA进行体外扩增,可得到快速、有效的鉴定结果。 4 仪器及用具 紫外线透射仪或凝胶成像系统,离心机,核酸电泳仪,pH计,移液器:10μL、20μL、100μL、 1000μL,PCR仪,水浴器、超纯水系统,电子天平。 5 试剂与材料 TAE缓冲液,三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl),乙二胺四乙酸(EDTA),十二烷基硫酸钠 (SDS),乙酸钠(NaAc),Taq酶,10×PCR缓冲液,25mmol/L镁离子(Mg2+),20mmol/L脱氧核苷三 磷酸(dNTP),5μLDNA荧光染料(GV),琼脂糖,溴酚蓝,高锰酸钾,三氯甲烷(氯仿),异戊醇,异丙醇, 乙醇。 6 症状识别法 柑桔黄龙病主要鉴定依据是田间出现的“叶片斑驳型黄化”和“黄梢”。叶片斑驳型黄化即叶片转绿 后从主、侧脉附近和叶片基部开始黄化,黄化部分扩展形成黄绿相间分布不均的斑驳,后来可以全叶黄 化。黄梢即在发病初期,绿色树冠上少部分新梢枝叶片黄化。有些柑桔结果树果实呈“红鼻子果”。在 柑桔黄龙病区符合上述典型症状的病苗、病树可直接鉴定为柑桔黄龙病。 对难以下结论的疑似病苗、病树,可根据具体情况选用以下一种或几种检测方法进行鉴定。 1GB/T29393—2012 7 指示植物鉴定法 7.1 指示植物鉴定柑桔接穗带菌 以椪柑作指示植物。鉴定时用带有2~3个病芽的接穗,在健康椪柑实生苗上进行嫁接。重复3次 (嫁接工具每次使用前用高锰酸钾溶液消毒)。待嫁接愈合后,在其上方约1cm处剪除指示植物的主 干。每株疑似病株至少嫁接30株以上健康椪柑,以健康椪柑实生苗作对照,定期观察、记载指示植物新 抽枝叶的症状。一般柑桔黄龙病在指示植物上的潜育期为4~12个月。符合第6章所描述的发病症状 可鉴定为柑桔黄龙病。 7.2 指示植物鉴定柑桔木虱带菌 从田间疑似病株上,采集柑桔木虱成虫50~100头,接到指示植物椪柑上饲养,定期观察、记载指示 植物症状。符合第6章描述的发病症状可鉴定接种柑桔木虱带有柑桔黄龙病菌。 8 PCR检测法 8.1 取样 取样包括疑似柑桔黄龙病叶片和柑桔木虱成虫二类。采集疑似柑桔黄龙病叶每样品20张叶片,直 接放于信封内(切忌塑料袋包装)。采集无病树和病树枝梢上柑桔木虱成虫每样品50~100头,置于 70%乙醇内浸泡2h~3h,然后取出放于塑料管内,供检测。样品可放入4℃冰箱保存。 将取样情况填入《植物有害生物调查抽样记录表》(见附录A)。 8.2 方法 按附录B的规定进行。 8.3 结果及判定 每次扩增反应均设空白对照、来源可靠的阳性对照和不含病原DNA的阴性对照各1个,每个样品 均进行3次重复。如果阳性对照电泳后出现一条563bp特异性条带,阴性对照和空白对照电泳后没有 条带,试验结果成立,否则,结果不成立。 在试验结果成立的前提下,供试样品出现与阳性对照一样的条带,样品判定为阳性,即检出柑桔黄 龙病菌;供试样品未出现与阳性对照一样的条带,样品判定为阴性,即不带柑桔黄龙病菌。 9 记录与档案 将检测结果填入表格《植物有害生物样本鉴定报告》(见附录C),将检测的有关数据、图片等资料整 理保存。 10 标本保存 柑桔叶片放入4℃冰箱保存和柑桔木虱浸70%乙醇保存。 2GB/T29393—2012 附 录 A (规范性附录) 植物有害生物调查抽样记录表 表A.1 植物有害生物调查抽样记录表 编号: 生产/经营者 地址及邮编 联系/负责人 联系电话 调查日期 抽样地点 样品 编号植物名称(中文名和学名)品种 名称植物生育期调查代表 株数或面积植物来源 症状描述: 发生与防控情况及原因: 抽样方法、部位和抽样比例: 备注: 抽样单位(盖章): 填表人(签名): 年 月 日生产/经营者 现场负责人 年 月 日 注:本单一式两联,第一联抽样单位存档,第二联交受检单位。 3GB/T29393—2012 附 录 B (规范性附录) 柑桔黄龙病菌PCR检测程序 B.1 病原物的提纯 B.1.1 碱裂解法 将待检柑桔木虱成虫5~10头放入200μL管中或待检叶片取叶脉0.5g剪碎后放入研钵,加入 50mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA(pH:8.0),浸没即可,磨碎;6000r/min离心3min,取上清液 加入等体积0.2mol/LNaOH+1%SDS,摇匀,冰浴放置10min;加入等上清液体积NaAc(pH:4.8~ 5.2),摇匀,冰浴10min;14000r/min离心5min,取上清液加入2~2.5倍无水乙醇,-20℃30min; 14000r/min离心15min,沉淀用75%、95%乙醇各洗一次,吹干,磷酸缓冲液(PE)溶解。 B.1.2 CTAB法 将待检柑桔木虱成虫或柑桔叶片取叶脉研磨成粉末状的干物质加入400μL预冷的CTABⅠ提取 缓冲液(100mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA,700mmol/LNaCl,pH8.0)中。加入500μL 65℃预热的CTABⅡ提取缓冲液(2%CTAB,50mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA,800mmol/L NaCl,pH8.0)混匀,65℃保温120min,其间不时轻缓颠倒混匀。待冷至室温后加入450μL氯仿/异 戊醇,轻缓颠倒混匀至溶液呈乳浊状。12000r/min离心2min至分相。将上清液转移至干净的离心 管中,加入5μLRNaseA储液,37℃下保温30min。依次加入600μL异丙醇及60μL乙酸钠溶液,轻 缓颠倒混匀。12000r/min离心10min,沉淀DNA。弃上清液后,加入800μL76%乙醇, 12000r/min离心10min,弃上清液后,再加入100μL70%乙醇洗涤沉淀,12000r/min离心5min,沉 淀DNA,除去残留的乙醇。DNA沉淀溶解于100μLTE缓冲液中,4℃保存备用。 B.2 检测体系 柑桔黄龙病菌PCR检测体系见表B.1,体系总体积25μL/管。 表B.1 柑桔黄龙病菌PCR检测体系 检测试剂 终 浓 度每管加入量 μL 10×PCR缓冲液 1× 2.5 25mmolMgCl2 2.5mmol 1.75 10mmoldNTP 0.2mmol 2.5 10μmol引物HLBP1 0.5μmol 0.2 10μmol引物HLBP2 0.5μmol 0.2 5U/μLTaqDNA聚合酶 1U/25μL 0.2 模板DNA 0.4~1.0μg 5 ddH2O — 12.65 总体积 — 25 4GB/T29393—2012 B.3 PCR扩增 PCR引物和反应条件见表B.2,用引物P1,P2进行扩增。 表B.2 PCR引物和反应条件 病 原 柑桔黄龙病菌 引物P1 TCTGTTTTCTTCGAGGTTGGTGA P2 ACCGCAAGACTCCTTACCAGGAAG PCR反应条件预变性 94℃预变性2min 扩增 94℃变性30s,60℃退火1min,72℃延伸1min 循环数 35个 后延伸 72℃延伸10min B.4 琼脂糖凝胶电泳 在100mLTAE电泳缓冲液中加入1g琼脂糖,加热融化后加入5μLDNA荧光染料(GV)制备凝 胶,凝固后进行电泳。8μL扩增产物加入2μL上样缓冲液,混匀后加入上样孔,80V恒压电泳,当溴 酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳,紫外线透射检测。 B.5 凝胶成像观察与记录 取出琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统观察,拍摄样品DNA扩增条带,记录观察结果,电子文档存档 备查。 5GB/T29393—2012 附 录 C (规范性附录) 植物有害生物样本鉴定报告 表C.1 植物有害生物样本鉴定报告 编号: 植物名称 品种名称 植物生育期 样品数量 取样部位 样品来源 送检日期 送检人 送检单位 联系电话 检测鉴定方法: 检测鉴定结果: 备注: 鉴定人(签名): 审核人(签名): 鉴定