ICS65.020.20 B05 中华人民共和国国家标准 GB/T29375—2012 马 铃薯脱毒试管苗繁育技术规程 Codeofpracticeforin-vitrovirusfreeseedpotatoesplantletsbreeding 2012-12-31发布 2013-06-20实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国蔬菜标准化技术委员会(SAC/TC467)归口。 本标准起草单位:内蒙古大学内蒙古马铃薯工程技术研究中心、中国标准化研究院、甘肃爱兰马铃 薯种业有限责任公司、定西马铃薯研究所、重庆市薯类脱毒种苗快繁中心、秘鲁国际马铃薯中心北京联 络处、四川省凉山州良圆马铃薯种业有限责任公司、内蒙古希森马铃薯种业有限公司、成都科欣农业生 物工程有限责任公司、北京辛普劳食品加工有限公司、湖南农业大学园艺学院、东北农业大学农学院、华 南农业大学园艺学院、云南省宣威市马铃薯种薯研发中心、福建省农业科学院作物研究所、河北省郑州 市蔬菜研究所、云南省丽江市农业科学研究所、中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、内蒙古铃 田生物技术有限公司。 本标准主要起草人:张若芳、杨丽、周爱兰、孙清华、吴蕾、杜密茹、巩秀峰、王义、宋荣庆、李进福、 黄振霖、谢开云、严欣、王官茂、陈涛、曲仁山、熊兴耀、王凤义、曹先维、展康、汤浩、吴焕章、王绍林、罗其友、 李文刚。 ⅠGB/T29375—2012 马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程 1 范围 本标准规定了马铃薯茎尖脱毒与组织培养、脱毒试管苗扩繁的技术要求和操作规程。 本标准适用于马铃薯脱毒试管苗的培育、扩繁。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB18133—2000 马铃薯脱毒种薯 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 叶原基 leafprimordium 在茎尖生长点的基部形成的突起。 3.2 茎尖 stemtip 芽顶端部分(0.1mm~10mm)其中包括分生组织(0.05mm~0.1mm)及芽原基和正在发育的叶 原基。 3.3 茎尖分生组织 meristem 茎部位具有持续或周期性分裂能力的细胞群。 3.4 离体培养 in-vitropropagation 从植物体分离出符合需要的器官、组织、细胞、原生质体等,通过无菌操作,在人工控制条件下进行 培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。 3.5 脱毒苗 in-vitrovirusfreeplantlet 经检测确认不带马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病 毒(PLRV)、马铃薯M病毒(PVM)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的试 管苗。 3.6 核心苗 coreplantlet 通过茎尖分生组织培养技术获得的经检测无病毒,经试种观察具有原品种典型性状的脱毒苗。 3.7 基础苗 basicplantlet 由核心苗繁殖的、经检测无病毒的脱毒苗。 1GB/T29375—2012 4 试管苗生产车间 4.1 布局原则 脱毒苗生产车间布局应遵循方便消毒、减少污染的原则,遵守操作流程。周围应无污染源,与大田 生产隔离。要具备更衣室、清洗室、配制室、灭菌室、无菌贮存室、接种室、培养室等,各房间应隔离。生 产环境应清洁、干燥,具有可提供充足自然和人工光源的组培室、车间或生产线。 4.2 布局平面示意图 图1 试管苗生产车间布局平面示意图 4.3 设备、试剂 试管苗生产的组培设备、试剂参见附录A。 4.4 卫生要求 4.4.1 接种室、培养室应保持卫生,定期消毒,每周至少消毒一次。按照40%的甲醛和高锰酸钾2∶1 的比例,40%的甲醛溶液10mL倒入5g高锰酸钾容器内(每立方米空间用量),进行熏蒸。密闭1d 后,通风。 4.4.2 接种前接种室应强制过滤通风。 4.4.3 每次使用超净工作台前,应提前20min打开紫外灯。接种时关闭紫外灯打开风机,超净工作台 面及内壁用75%乙醇擦拭消毒。 4.4.4 操作使用的所有工具,使用前应灭菌。操作过程中镊子、剪刀、解剖刀等工具,每次使用前接触 植物材料的部分应灼烧消毒或插入高温灭菌器中灭菌,冷却后使用,避免交叉污染。 4.4.5 工作人员应穿消毒工作服,用肥皂洗净双手,操作过程中,手和工作台面要经常用75%的乙醇 清擦。 4.4.6 若将温室作为培养室,在温室配备有降温水帘和风机,水帘外进风方向应加孔径0.247mm (60目)网纱。温室内门口有缓冲间,在缓冲间应有消毒装置,可放入生石灰或其他消毒剂,工作人员进 入时鞋底消毒。 4.4.7 发现污染及时清除。 2GB/T29375—2012 5 茎尖脱毒与培养 5.1 脱毒材料的选取 5.1.1 田间选择 5.1.1.1 在土壤肥力中等的地块,于现蕾期至开花期选择生长势强、具备原品种典型性状的健康植株, 做好标记。 5.1.1.2 生育后期到收获期,在已做标记的植株中进行薯块复选。选择无病斑、虫蛀、机械损伤而且皮 色、肉色、薯形、芽眼等性状符合品种特征的幼龄薯,清洗泥土后催芽作为脱毒材料;或选取健康且具备 品种典型性状植株的中、下部短枝茎尖或腋芽进行茎尖剥离。 5.1.2 病毒检测筛选 入选的块茎或植株,按照GB18133—2000中附录B的方法检测类病毒(PSTVd);按照GB18133— 2000中附录A的方法检测病毒。筛选无类病毒(PSTVd)的块茎或植株作为茎尖脱毒基础材料;若检 测到没有带病毒的块茎或植株,可直接剥较大的茎尖。其后可不经试种观察直接进行扩繁培养。 5.1.3 催芽处理和病毒钝化 5.1.3.1 块茎可通过自然方法出芽或通过人工方法(用1%硫脲+5mg/L赤霉素的溶液浸种5min) 打破休眠催芽。 5.1.3.2 自然出芽的情况下,块茎长出2cm~3cm的新芽。对含有S病毒、X病毒的块茎需置于 37℃±1℃培养箱中处理3周~4周,钝化病毒。 5.1.3.3 人工打破休眠催芽的情况下,可采用0.1%多菌灵溶液浸泡30min或75%乙醇喷湿进行表 面消毒,置于25℃黑暗条件下催芽;或播种于含水量20%灭菌细沙中发芽(水中含5mg/L多菌灵),块 茎长出2cm~3cm的新芽。对含有S病毒、X病毒的块茎需置于37℃±1℃培养箱中处理3周~ 4周,钝化病毒。 5.2 茎尖培养 5.2.1 茎尖培养基的制备 5.2.1.1 茎尖培养基配方参见附录B。 5.2.1.2 将制备好的茎尖培养基快速分装于容器中,用封口膜封口。 5.2.1.3 将盛有培养基的容器整齐排列于灭菌锅内,1.1kg/cm2、121℃高压灭菌20min,冷却后在无 菌贮存室放置3d~5d,无污染的培养基放到超净工作台备用。 5.2.2 材料消毒 取经催芽处理和病毒钝化处理的块茎的顶芽、2cm~3cm的侧芽,剪去外叶,用自来水冲洗30min 后,移入接种室进行严格消毒。先用75%乙醇浸泡30s,再用50g/L的漂白粉液浸泡7min~10min 或0.1%的氯化汞溶液浸泡5min~10min,然后用无菌水冲洗4次~5次。 5.2.3 茎尖剥离与接种 接种在超净工作台上操作。剥去外叶,借助40×双目解剖镜,剥离茎尖直至露出半圆形光滑生长 点,用解剖刀或解剖针从0.1mm~0.3mm处切,带1个~2个叶原基。迅速接种于盛有茎尖培养基 的容器中,进行离体培养。用酒精灯烤干容器口并封口,在容器上注明编号、品种名称、接种时间。 3GB/T29375—2012 待看到明显伸长的小茎、叶原基形成可见的小叶时,转移到盛有MS培养基(配方参见附录C)的容 器内培养,培养成带4个~5个叶片的试管苗。 5.2.4 培养条件 试管苗在温度20℃~25℃、相对湿度70%、光照强度2000lx~3000lx的条件下培养,光照时数 16h/d。 6 病毒检测 6.1 将试管苗按瓶上的编号,在超净工作台内将每株的上部1/3~1/2茎段转入新的培养瓶中,编号 不变。 6.2 同时再将植株下部1/3~1/2的茎段装入病毒检测的样品袋中。取样时样品不能粘有培养基。 6.3 检测方法按照GB18133—2000的附录A执行。筛选出不含PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM、 PVA病毒的脱毒苗。 7 试种观察 经检测不带病毒的试管苗进行试种观察。将每个试管苗取出一部分移栽到防虫网棚,结出的小薯 种植到田间试种观察,检验其是否发生变异,符合原品种的典型性状的脱毒苗即为核心苗。 8 基础苗培养 8.1 在超净工作台上对核心苗切段扩繁。将培养容器置于超净工作台上,瓶口用75%乙醇擦拭消毒, 用镊子取出核心苗,按单茎节切段,每个切段至少带1个叶片。 8.2 操作时将剪下的切段腋芽朝上插入MS培养基(配方参见附录C)或其他脱毒苗扩繁培养基上(配 方参见附录D),用酒精灯烘烤瓶口,用封口膜封好,注明编号、品种名称和接种时间。 8.3 培养条件:置于温度22℃、相对湿度70%、光照强度2000lx~3000lx、光照时数16h/d的条件 下培养。 9 基础苗保存 9.1 选择保存培养基(配方参见附录E)保存基础苗。 9.2 将基础苗置于温度13℃~16℃、相对湿度70%、光照强度3000lx、光照时数10h/d~14h/d的 条件下使其缓慢生长,继代培养出一定数量的