ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28978—2012 马 铃薯环腐病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofClavibactermichiganensissubsp.sepedonicus 2012-12-31发布 2013-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国福建 出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:廖富荣、林石明、吴媛、沈建国、吴志毅、陈青、张明哲、陈红运、黄蓬英。 ⅠGB/T28978—2012 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了基于生理生化特性、致病性特征、血清学、分子生物学特征的马铃薯环腐病菌检测和 鉴定方法。 本标准适用于马铃薯环腐病菌在马铃薯块茎、植株上的检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T1135.5—2007 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法 3 马铃薯环腐病菌基本信息 中文名称:密执安棒状杆菌环腐亚种 俗 名:马铃薯环腐病菌 拉丁学名:Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicus 属于微杆菌科(Microbacteriaceae)、棒形杆菌属(Clavibacter)的成员。 马铃薯环腐病菌(以下简称Cms)引起马铃薯环腐病,可通过带病的种薯进行远距离传播,也报道 可通过番茄等种子传播,关于Cms的其他信息参见附录A。 4 方法原理 马铃薯环腐病菌具有独特的培养性状和生理生化特征,该病菌的生理生化特性、致病性特征,以及 血清学、分子生物学特征是制定本标准的主要依据。 5 主要仪器设备 本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备: 微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平(感量:0.001g)、生物培养箱、荧光显微镜、PCR仪、荧光 PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、BIOLOG自动微生物鉴定系统、浊度 计、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器(1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL)。 6 检测与鉴定 6.1 症状检查 马铃薯环腐病菌侵染马铃薯植株后,在马铃薯块茎、植株上可产生症状(参见附录A),通过症状检 查可以初步判断是否为Cms引起的病害。 1GB/T28978—2012 6.2 表现症状样品中病原菌的分离 6.2.1 培养基的选择 从马铃薯块茎、茎杆、叶片等植物组织中分离病原菌选择用MTNA培养基(见B.1)或NCP-88培 养基(见B.2),用酵母葡萄糖矿物盐培养基(YGM)(见B.3)或葡萄糖营养琼脂(NDA)(见B.4)进一步 纯化。 6.2.2 分离纯化 按附录C给出的方法,从发病的植物组织中分离病原菌。当分离到疑似Cms的纯培养后,按6.4~ 6.6给出的方法进行鉴定,然后按6.7给出的方法进行致病性测定。 6.3 潜伏侵染样品初筛与分离 6.3.1 样品制备 按附录D的给出的方法,每份检测样品取200个马铃薯块茎,洗涤去除表面土壤后,切取维管束组 织制备马铃薯块茎悬浮液。 6.3.2 初筛检测 利用DAS-ELISA方法(按6.5给出的方法)对制备马铃薯块茎悬浮液进行初筛检测。如果DAS- ELISA检测结果为阳性的,则用RT-PCR方法(按6.6.1给出的方法)进行验证。 6.3.3 生物学测定 把初筛检测阳性的马铃薯块茎悬浮液接种到感病的茄子上,进行生物学测定(按6.7给出的方法)。 6.3.4 分离纯化 按附录C给出的方法,把初筛检测阳性的马铃薯块茎悬浮液进行系列稀释(10-1、10-2、10-3),分 别取100μL涂布到MTNA培养基(见B.1)或NCP-88培养基中(见B.2)上进行分离培养。 对疑似Cms菌落按6.4~6.6给出的方法进行鉴定,然后按6.7给出的方法进行致病性测定。 注:分离纯化可以和生物学测定平行进行。 6.4 BIOLOG鉴定 按附录E给出的方法,把疑似Cms的纯培养接种到BUG培养基(见B.7)上富集培养,然后接种到 GENⅢ鉴定板上进行鉴定。 6.5 DAS-ELISA检测 对于表现症状的植物组织样品,按1∶10的比例(质量∶体积)在检测样品中加入样品提取缓冲液 (见B.10),研磨成匀浆后,离心,上清液作为检测样品。 对于已分离纯化的细菌纯培养,用样品提取缓冲液(见B.10)制备约106CFU/mL的菌悬液作为 检测样品。 对于潜伏侵染的植物组织样品,制成样品悬浮液后(见附录D),用样品悬浮液进行检测。 按试剂操作说明书或按SN/T1135.5—2007中5.2给出的试验方法。用Cms已知菌株作阳性对 照,并设置相应的阴性对照。 2GB/T28978—2012 6.6 分子生物学检测 6.6.1 PCR检测 本标准提供多个检测Cms的PCR方法,任意选用其中一种PCR法进行检测,按F.1和F.2给出 的方法。用Cms已知菌株作阳性对照,并设置相应的阴性对照和空白对照。 6.6.2 实时荧光PCR检测 本标准提供2个检测Cms的实时荧光PCR方法,任意选用其中一种方法进行检测,按F.1和F.3 给出的方法。用Cms已知菌株作阳性对照,并设置相应的阴性对照和空白对照。 6.7 致病性测定 按附录G给出的方法,把培养3d的纯培养物制备成约106CFU/mL菌悬液,接种到5~10株茄子 幼苗的茎杆上。用新鲜配制的马铃薯环腐病菌已知菌株制备成约05CFU/mL~106CFU/mL的菌悬 液作为阳性对照,接种5株茄子幼苗。用无菌水作为阴性对照,接种5株茄子幼苗。 7 结果判定与报告 7.1 结果判定 7.1.1 当BIOLOG检测或DAS-EILS检测或分子生物学检测(PCR方法或实时荧光PCR方法),其中 两种基于不同原理的方法检测结果为阳性、且致病性测定为阳性时,判定为马铃薯环腐病菌。 7.1.2 当DAS-EILSA检测或分子生物学检测(PCR方法或实时荧光PCR方法)初筛检测结果为阴 性,或只有其中一种检测方法结果为阳性时,判定为非马铃薯环腐病菌。 7.2 结果记录与保存 7.2.1 记录各项实验数据,包括样品种类、来源,检测时间、地点、方法和结果等。DAS-ELISA检测结 果保存吸光值的数据报告,PCR检测结果保存电泳照片,实时荧光PCR检测结果保存采集的数据。 7.2.2 检出马铃薯环腐病菌的马铃薯块茎、茎秆、或叶片等样品,在超低温冰箱中保存,以备复核;分离 纯化的马铃薯环腐病菌保存到超低温冰箱中,或冻干后低温保存。 3GB/T28978—2012 附 录 A (资料性附录) 马铃薯环腐病菌相关信息 A.1 名称与分类地位 中文名称:密执安棒形杆菌马铃薯环腐亚种、密执安棒形杆菌环腐亚种、密执安棍状杆菌环腐亚种 拉丁名称:Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicus(Speeckermann&Kotthof,1914) Davis,Gillaspie,Vidaver&Harris1984. 同物异名:Corynebacteriummichiganensissubsp.sepedonicum(Spieckermann&Kotthof,1914) Carlson&Vidaver,1982;Corynebacteriummichiganensispv.sepedonicum(Spieckermann& Kotthof,1914)Dye&Kemp1977;Corynebacteriumsepedonicum(Spieckermann&Kotthof,1914) Skaptason&Burkholder1942. 俗 称:马铃薯环腐病菌 英文名称:Potatoringrot;bacterialringrotofpotato;ringrotofpotato;vascularpotatowilt 英文缩写:CMS或Cms 分类地位:细菌界(Bacteria),厚壁菌门(Firmicutes),放线菌纲(Actinobacteria),放线菌亚纲(Acti- nobacteridae),放线菌目(Actinomycetales),微球菌亚目(Micrococcineae),微杆菌科(Microbacteriaceae), 棒形杆菌属(Clavibacter) A.2 症状特征 A.2.1 马铃薯块茎 A.2.1.1 马铃薯块茎上的症状 块茎外部症状不明显,但横切后可看到维管束变为乳黄色以至黑褐色,重病薯维管束变色部分可连 成一圈、成环状,严重时皮层与髓部可以脱离。腐烂通常是从顶端的维管组织到块茎的中心皮层逐步发 展的。用手挤压切开的病薯,可看到维管束部分有乳白色或黄色菌液流出。经越冬贮藏的病薯,芽眼干 枯变黑或外表开裂。在病害晚期,由于次生菌的进一步侵染,维管束也可变黑并腐烂。 A.2.1.2 与青枯病(褐腐病)的区别 与茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的青枯病(褐腐病)区别在于:在病