ICS65.020 B04 中华人民共和国国家标准 GB/T28660—2012 马 铃薯种薯真实性和纯度鉴定 SSR分子标记 Genuinenessandpurityverificationofpotatoseed-tuber— SSRmolecularmarker 2012-09-03发布 2012-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC37)归口。 本标准起草单位:云南师范大学薯类作物研究所、中国农科院蔬菜花卉研究所、东北农业大学农学 院、华中农业大学园艺学院、黑龙江省农业科学院农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心、国际 马铃薯中心(CIP)北京联络处。 本标准主要起草人:李灿辉、郝大海、金黎平、杨仕忠、管朝旭、黄三文、陈伊里、谢从华、白艳菊、 谢开云。 ⅠGB/T28660—2012 马铃薯种薯真实性和纯度鉴定 SSR分子标记 1 范围 本标准规定了SSR分子标记鉴定马铃薯(SolanumtuberosumL.)品种的方法。 本标准适用于马铃薯种薯真实性和纯度的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB18133马铃薯脱毒种薯 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 简单序列重复 simplesequencerepeat;SSR 基因组中由1个~6个核苷酸组成的基本单位串联多次重复构成的DNA序列。 3.2 聚合酶链式反应 polymerasechainreaction;PCR 在耐热DNA聚合酶作用下,于体外快速大量特异性扩增特定DNA序列的方法。 4 仪器和试剂 4.1 仪器及用具 4.1.1 梯度PCR仪。 4.1.2 低温高速离心机。 4.1.3 电泳仪(满足3000V稳压)及配套电泳槽。 4.1.4 凝胶成像分析系统。 4.1.5 冰箱(-28℃~4℃)。 4.1.6 紫外/可见分光光度计。 4.1.7 电热恒温水浴锅(37℃、42℃、65℃和95℃)。 4.1.8 制冰机。 4.1.9 涡旋仪。 4.1.10 高压灭菌器。 4.1.11 液氮罐。 4.1.12 酸度计(pH计)。 4.1.13 脱色摇床。 1GB/T28660—2012 4.1.14 微量移液器(0.5μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL)及配套的枪头。 4.1.15 其他用具:PCR管、量筒(100mL~1000mL)、1.5mL离心管和配套的研磨棒。 4.2 试剂 4.2.1 常用贮备液:见附录A。 4.2.2 DNA提取试剂:见附录B。 4.2.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂:见附录C。 4.2.4 银染试剂:见附录D。 4.2.5 SSR(简单重复序列)标记引物:见附录E。 4.2.6 TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)和配套的PCR缓冲液。 4.2.7 DNAMarker(50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、500bp)。 4.2.8 无DNA酶的RNA酶A(DNase-freeRNaseA,10mg/mL)。 4.2.9 β-巯基乙醇。 4.2.10 四甲基二乙胺(TEMED)。 4.2.11 异丙醇。 4.2.12 乙醇(70%、90%、95%)。 4.2.13 灭菌双蒸水(ddH2O)。 5 供试材料 5.1 取样 按照GB18133要求的方法,采集大田植株或块茎作为检测样品。 5.2 样品保存 选取适量样品,装入冻存管,液氮速冻,置冰箱(-20℃以下)中保存备用(有效保存期约6个月)。 6 程序 6.1 总DNA提取 6.1.1 称取100mg样品,置于预冷1.5mL离心管中,液氮冷冻下迅速研磨成细粉。依次加入700μL 的两倍十六烷基三甲基溴化铵缓冲液(见表B.1)和2μL的β-巯基乙醇,涡旋混匀。 6.1.2 置65℃水浴1h,期间每隔10min摇动混匀一次。 6.1.3 冰上冷却约10min后,加入700μL的三氯甲烷∶异戊醇(24∶1)混合液(见表B.2),涡旋混 合,轻缓颠倒混匀数次。12000r/min离心5min。 6.1.4 吸取上层水相至新1.5mL离心管中,加入等体积(400μL~500μL)的预冷异丙醇。轻缓颠 倒混匀,4℃冰箱静置30min后,12000r/min离心15min。 6.1.5 弃上清液。向离心管中加入70%乙醇1.0mL,静置3min后,12000r/min离心20min。小心 倒出70%乙醇,再加入90%乙醇1.0mL,静置5min后,12000r/min离心10min,小心倒去乙醇。在 干净的吸水纸上倒置离心管,自然干燥15min。晾干的DNA,应为透明状。 6.1.6 加入100μL的1×TE缓冲液[将10倍三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液(见表B.3)稀 释10倍并灭菌]溶解DNA,再加入2μL的无DNA酶的RNA酶A(10mg/mL)。37℃温浴1h去除 RNA。4℃冰箱放置备用。 6.1.7 取DNA提取液1μL~5μL于新的1.5mL离心管中,加入1×TE缓冲液稀释至1.0mL,混 2GB/T28660—2012 匀后转入石英比色皿中,用紫外/可见分光光度计测定OD260和OD280下的光密度值。按式(1)计算提取 液中DNA浓度,并检测质量(OD260/OD280比值为1.8~1.9表明纯度较高)。 dsDNA=OD260×t×50 1000…………………………(1) 式中: dsDNA———双链DNA分子的含量,单位为微克每毫升(μg/mL); OD260———260nm下的光密度值; t ———稀释倍数。 6.1.8 用1×TE缓冲液将所提取的总DNA稀释为50ng/μL,根据每次用量分装,置-20℃冰箱保存 备用。 6.2 PCR反应 6.2.1 PCR反应体系 在冰盘中或4℃条件下按表1所列成分和用量,顺序依次加入PCR管,准备PCR反应体系。 表1 PCR反应体系(供1个样品、1对SSR引物检测,25μL) 成 分 用量/μL ddH2O 16.1 10×PCR缓冲液 2.5 dNTPs(2.5mmol/L,每一种) 2.0 正向引物(10mmol/L) 1.0 反向引物(10mmol/L) 1.0 TaqDNA聚合酶(2.5U/μL) 0.4 DNA模板(50ng/μL) 2.0 总体积 25.0 6.2.2 反应程序 按表2程序设置PCR反应流程。 表2 PCR反应程序 反应程序 时间 备注 94℃预变性 5min 94℃变性 1min 55℃退火 1min 不同SSR引物所需的退火温度见附录E 72℃延伸 1min 循环次数 35次 变性→退火→延伸反应循环次数 72℃延伸 5min 4℃终止反应 3GB/T28660—2012 6.2.3 PCR产物变性处理 PCR结束后,于25μL的反应体系中加入7.0μL的上样缓冲液(见表A.4),95℃水浴变性处理 5min后,立即转入冰浴冷却,备用。 6.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 6.3.1 电泳玻璃板清洗 用洗涤剂仔细清洗电泳玻璃板(长板和短板),自来水漂洗干净,再用蒸馏水冲洗,斜置滤干,最后用 95%乙醇冲洗,并空置晾干。使用之前,再次用无水乙醇将玻璃板擦拭干净。 注:洗板时,长板和短板分别单独清洗,以避免相互污染。 6.3.2 电泳玻璃板处理 短板处理:用镜头纸蘸取适量2%剥离硅烷溶液(见表C.1),均匀地涂布在短板上;5min~10min 后,喷施数毫升95%乙醇,用干净的镜头纸擦去多余的2%剥离硅烷;空置约20min,晾干。 长板处理:更换新手套,用镜头纸蘸取适量亲和硅烷溶液(见表C.2),均匀涂布在长板上;4min~ 5min后,用镜头纸蘸取95%乙醇沿一定方向轻轻地擦拭;此后,再用95%乙醇沿着与前次操作方向相 垂直的方向轻轻地擦拭,如此擦洗3次,以去除多余的亲和硅烷;空置约20min,晾干。 注:剥离硅烷和亲和硅烷均有剧毒,涂板处理时,需带手套操作,避免两种溶液相互污染。剥离硅烷溶液处理的目 的是使短板容易与凝胶分离;亲和硅烷溶液处理的目的是使聚丙烯酰胺凝胶能很好地附着在长板上面,不易剥离。 6.3.3 胶槽装配 将长板、短板和压条装配好,周边用胶带密封,用夹子夹紧,插入合适的梳子,以方便灌胶的倾斜角 度放置在安全支架上。 6.3.4 灌胶 取6.0%变性聚丙烯酰胺贮备液(见表C.5)60mL,加入10%过硫酸铵贮备液(见表C.4)300μL, 四甲基二乙胺(TEMED)60μL,轻轻混匀。轻缓抽出梳子,沿压条边缘轻缓地将混匀的凝胶溶液注入 胶槽中,及时清除可能出现的气泡后,重新将梳子插入至适当位置。将胶板调至水平位置,室温下 (20℃~25℃)放置2h以上,以便凝胶完全凝固。 6.3.5 预电泳 待凝胶完全凝固后,小心拔出梳子,并用1×TBE缓冲液[将10倍三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺 四乙酸缓冲液(见表A.3)稀释10倍]清洗和整理样品槽。去掉密封胶带,用吸水纸将玻璃板擦干,以防 电泳时短路。将胶板装到电泳槽中,加入电泳缓冲液(1×TBE缓冲液),清除样品槽中的气泡,接通电 源,以70W的恒定功率预电泳30min。 6.3.6 电泳