ICS65.020.30 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T28630.5—2012 白 斑综合征(WSD)诊断规程 第5部分:新鲜组织的T-E染色法 Diagnosticprotocolsforwhitespotdisease— Part5:T-Estainingmethodwithfreshtissue 2012-07-31发布 2012-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 GB/T28630《白斑综合征(WSD)诊断规程》分为五个部分: ———第1部分:核酸探针斑点杂交检测法; ———第2部分:套式PCR检测法; ———第3部分:原位杂交检测法; ———第4部分:组织病理学诊断法; ———第5部分:新鲜组织的T-E染色法。 本部分为GB/T28630的第5部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本部分由中华人民共和国农业部提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本部分起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业部全国水产技术推广总站。 本部分主要起草人:黄倢、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦、刘莉。 ⅠGB/T28630.5—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第5部分:新鲜组织的T-E染色法 1 范围 GB/T28630的本部分规定了白斑综合征新鲜组织的T-E染色法所需试剂与材料、仪器设备、操作 步骤和结果判定。 本部分适用于在现场或诊断实验室对患病濒死的对虾仔虾、幼虾或成虾进行快速诊断,不适用于对 潜伏性感染或病毒的非感染性携带的标本进行诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件。 GB/T28630.4—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第4部分:组织病理学诊断法 3 原理 3.1 白斑综合征的病原和病理学特征 见GB/T28630.4—2012的2.1。 3.2 技术原理 台盼蓝含有一个弱碱性基团和一个强酸性基团,其弱碱性基团可与核酸相结合,而强酸性基团的存 在,使台盼蓝与弱酸性染料伊红互混而不发生沉淀。这样,台盼蓝与伊红的混合液就能一次性地使新鲜 组织的细胞核染上蓝色,又能将细胞质染上红色。 4 试剂和材料 4.1 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 4.2 T-E染色液:见附录A的规定。 5 仪器设备 5.1 解剖刀。 5.2 尖头镊子。 5.3 医用剪刀。 5.4 载玻片。 5.5 盖玻片。 5.6 光学显微镜:带高倍镜(40×)和油镜(100×)。 1GB/T28630.5—2012 5.7 吸水纸。 5.8 滴管。 6 操作步骤 6.1 样品采集的要求见GB/T28630.4—2012中附录B的规定。 6.2 仔虾及体长小于3cm的幼虾,取其头胸部,在载玻片上用解剖刀切碎;体长大于3cm的幼虾及成 虾,揭开头胸甲,以尖头镊子取出对虾胃,置于载玻片上,用解剖刀轻轻刮下其上皮等组织。 6.3 在组织浆上滴加2滴T-E染色液,混匀,常温放置染色3min~5min。 6.4 盖上盖玻片,覆上数层吸水纸,轻压以吸去多余染液,除去吸水纸,镜下观察。 7 结果判定 7.1 正常的对虾组织细胞经T-E染色后,可观察到细胞质为红色,细胞核质为淡蓝色,染色质为深蓝 色,核仁为深蓝色或蓝紫色。 7.2 白斑综合征病毒(WSSV)感染发病的濒死对虾细胞核可观察到“空泡化”形态,“空泡化”是由于细 胞核肿大,核仁消失,染色质边移,核内出现病毒发生基质或包涵体(inclusion)所致。其形态表现为细 胞核周圈染色发蓝而核内蓝色消退,并不同程度地偏红,看上去呈一个蓝色的环。有些“空泡”偏离核的 中心,使核的形态呈一戒指状。“空泡化”的细胞核多呈球形,所占比例与对虾发病严重程度有关,在濒 死对虾中,可观察到60%以上的上皮组织、结缔组织细胞核出现空泡化,在空胃而行为较活泼的病虾 中,这种形态的细胞核约占这些组织细胞核的5%以下。在有些发病急、病情重的对虾中,可观察到细 胞核严重膨大,核周圈蓝色变窄变淡,而核内着色鲜红。 7.3 在多个视野观察到大量典型的受感染细胞核可作为确诊的依据,诊断结果可疑时,补充组织病理 学诊断、核酸探针斑点杂交检测或套式PCR检测进行结果确认。 2GB/T28630.5—2012 附 录 A (规范性附录) 试剂配方 A.1 T-E染色液 台盼蓝 0.6g 伊红Y(水溶性) 0.2g 苯酚 0.5g 氯化钠 0.5g 甘油 20mL 水 80mL 室温贮存。GB/T28630.5—2012