ICS65.020.30 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T28630.2—2012 白 斑综合征(WSD)诊断规程 第2部分:套式PCR检测法 Diagnosticprotocolsforwhitespotdisease— Part2:NestedPCRmethod 2012-07-31发布 2012-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 GB/T28630《白斑综合征(WSD)诊断规程》分为五个部分: ———第1部分:核酸探针斑点杂交检测法; ———第2部分:套式PCR检测法; ———第3部分:原位杂交检测法; ———第4部分:组织病理学诊断法; ———第5部分:新鲜组织的T-E染色法。 本部分为GB/T28630的第2部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本部分由中华人民共和国农业部提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本部分起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业部全国水产技术推广总站。 本部分主要起草人:黄倢、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦、刘莉。 ⅠGB/T28630.2—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第2部分:套式PCR检测法 警告:使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验,本标准并未指出所有可能的安全问题。 使用者有责任采取适当的安全和健康措施,并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 GB/T28630的本部分规定了白斑综合征病原的套式PCR检测方法所需试剂与材料、仪器设备、 操作步骤和结果判定。 本部分适用于在对虾的各种样品、环境生物和饵料生物的各种样品,以及其他各种非生物样品中对 白斑综合征病原带毒情况的高灵敏度定性检测,以进行病原筛查和疾病的确诊。 本部分单独使用时不适用于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件。 GB/T28630.4—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第4部分:组织病理学诊断法 3 原理 3.1 白斑综合征的病原和病理学特征 见GB/T28630.4—2012的2.1。 3.2 技术原理 聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)是以待测样品的一段DNA作为模板,以与模板 两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物,在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下,利用依赖 DNA的DNA聚合酶的合成作用。经过数十次变性、退火和延伸的反应循环,使模板上介于两个引物 之间的DNA片段得到特异性地级数扩增,再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段,从而可揭示 微量病毒DNA的存在。套式PCR是在第一步PCR扩增的产物内,再用一对引物进行第二步PCR扩 增。套式PCR可大大增加PCR检测的灵敏度和反应特异性。 4 试剂和材料 4.1 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 4.2 无水乙醇。 4.3 液体石蜡。 4.4 含氯消毒剂:医用品或水产药物。 4.5 琼脂糖:电泳级。 1GB/T28630.2—2012 4.6 1kbDNAMarker:生化试剂。 4.7 Tris平衡酚(饱和酚):生化试剂。 4.8 TaqDNA聚合酶(5U/μL):生化试剂,-20℃保存。 4.9 10×PCR缓冲液:生化试剂,无Mg2+,随TaqDNA聚合酶提供,-20℃保存。 4.10 氯化镁溶液(25mmol/L):生化试剂,-20℃保存。 4.11 dNTP:生化试剂,含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各10mmol/L的混合物,-20℃保存。 4.12 10μmol/L引物F1:5′-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3′,外侧正向引物,用来扩增 WSSVDNA的1447bp产物,-20℃保存。 4.13 10μmol/L引物R1:5′-TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA-3′,外侧反向引物,用来扩增 WSSVDNA的1447bp产物,-20℃保存。 4.14 10μmol/L引物F2:5′-GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA-3′,内侧正向引物,用来从第一步 PCR扩增的1447bp产物中再扩增出941bp的产物,-20℃保存。 4.15 10μmol/L引物R2:5′-TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT-3′,内侧反向引物,用来从第一步 PCR扩增的1447bp产物中再扩增出941bp的产物,-20℃保存。 4.16 10μmol/L引物F3:5′-TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG-3′,正向内参照引物,扩增十足 类动物DNA中848bp的片段,-20℃保存。 4.17 10μmol/L引物R3:5′-TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-3′,反向内参照引物,扩增十足 类动物DNA中848bp的片段,-20℃保存。 4.18 20mg/mL蛋白酶K:见附录A的规定。 4.19 TE缓冲液:见附录A的规定。 4.20 抽提缓冲液:见附录A的规定。 4.21 10mol/L乙酸铵:见附录A的规定。 4.22 酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24∶1):见附录A的规定。 4.23 1×电泳缓冲液:见附录A的规定。 4.24 6×载样缓冲液:见附录A的规定。 4.25 10mg/mL溴化乙锭(EB)贮存液:见附录A的规定。 4.26 70%乙醇:见附录A的规定。 4.27 阳性对照为已知受WSSV感染且PCR结果显示明显阳性结果的WSSVDNA模板,-20℃ 保存。 4.28 阴性对照为已知未受WSSV感染且PCR结果显示阴性结果的对虾组织DNA模板,-20℃ 保存。 4.29 空白对照以无菌双蒸水为模板。 5 器材和设备 5.1 PCR仪。 5.2 电泳仪:输出直流电压0V~600V。 5.3 水平电泳槽:50mL~500mL,带有5cm~20cm宽度的凝胶船及相应的样孔梳。 5.4 紫外观察仪:可遮挡可见光干扰,在230nm~300nm波长对凝胶发射紫外线,推荐带照相机架。 5.5 台式高速离心机:用于PCR前区对1.5mL塑料微量离心管离心,转速可达12000r/min以上。 5.6 手掌型离心机:用于PCR后区对0.2mLPCR管的离心,塑料转头,转速2000r/min~ 4000r/min。 5.7 水浴锅。 2GB/T28630.2—2012 5.8 普通冰箱:具冷藏箱,并带-18℃以下冷冻箱体。 5.9 微量移液器:量程0.5μL~10μL、5μL~40μL、40μL~200μL、200μL~1000μL各4支,应按 洁净区、样品区、扩增区和电泳区分为4套隔离使用。 5.10 电炉或微波炉等其他加热设备:可满足10mL~50mL液体在三角烧瓶中加热20min。 5.11 三角烧瓶:容量100mL~250mL。 5.12 灭菌0.2mLPCR管:经高压蒸汽灭菌,一次性使用。 5.13 微量移液器枪头:与各种规格的微量移液器配套使用,经高压蒸汽灭菌,并一次性使用。 5.14 医用剪刀。 5.15 医用镊子。 5.16 玻璃研磨棒或塑料研磨棒:用于在1.5mL塑料离心管中研磨样品。 5.17 1.5mL塑料微量离心管:经高压蒸汽灭菌,一次性使用。 5.18 塑料或乳胶手套:一次性使用。 5.19 吸水纸。 6 操作步骤 6.1 准备PCR的反应体系 6.1.1 PCR反应体系的准备应在洁净区完成。 6.1.2 第一步PCR的反应体系中使用引物F1和R1,模板为抽提的样品DNA,其反应预混物见表1。 表1 100份第一步PCR的反应预混物所需试剂组成 试 剂 25μL体系 50μL体系 100μL体系 试剂终浓度 10×PCR缓冲液(无Mg2+)250μL 500μL 1000μL 1×PCR缓冲液(无Mg2+) 氯化镁溶液(25mmol/L) 150μL 300μL 600μL 1.5mmol/L dNTP 50μL 100μL 200μL 200μmol/L 10μmol/L引物F1 250μL 500μL 1000μL 1μmol/L 10μmol/L引物R1 250μL 500μL 1000μL 1μmol/L 灭菌双蒸水 1440μL 2880μL 5760μL — TaqDNA聚合酶(5U/μL) 10μL 20μL 40μL 0.02U/μL 100份反应预混物总体积 2400μL 4800μL 9600μL 注:25μL体系模板量1μL/反应管;50μL体系模板量2μL/反应管;100μL体系模板量4μL/反应管。 6.1.3 第二步PCR的反应体系中使用引物F2和R2,其反应预混物见表2。 表2 100份第二步PCR的反应预混物所需试剂组成 试 剂 25μL体系 50μL体系 100μL体系 试剂终浓度 10×PCR缓冲液(无Mg2+)250μL 500μL 1000μL 1×PCR缓冲液(无Mg2+) 氯化镁溶液(25mmol/L) 150μL 300μL 600μL 1.5mmol/L dNTP 50μL 100μL 200μL 200μmol/L 10μmol/L引物F2 250μL 500μL 1000μL 1μmol/L 3GB/T28630.2—2012 表2(续) 试 剂 25μL体系 50μL