ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28103—2011 小 麦线条花叶病毒检疫鉴定方法 Detectionandidentificationofwheatstreakmosaicvirus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国天津出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:郭京泽、廖芳、刘跃庭、张裕君、刘勇、崔铁军、王金成。 ⅠGB/T28103—2011 小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了小麦线条花叶病毒(wheatstreakmosaicvirus)检疫鉴定方法。 本标准适用于禾本科植物种子和苗木中的小麦线条花叶病毒检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T1840 植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 小麦线条花叶病毒基本信息 小麦线条花叶病毒wheatstreakmosaicvirus,属于马铃薯Y病毒科Potyviridae,小麦花叶病毒属 Tritimovirus。缩写:WSMV。 小麦线条花叶病毒传播途径有:汁液摩擦传播;种传;介体传播。 该病毒容易通过汁液摩擦方式近距离扩散。该病毒能通过带病小麦种子的调运远距离传播。该病 毒的传毒介体为小麦卷叶螨Aceriatosichella,成虫和若虫均可带毒传染,卵不传病毒。 小麦线条花叶病毒其他信息参见附录A。 4 方法原理 小麦线条花叶病毒的形态学特征、分子生物学特性和血清学特性是该病毒检疫鉴定方法的主要依 据。采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法、植物病毒免疫电镜检测方法、反转录聚合酶链式反应检测 方法,确定样品中带有的小麦线条花叶病毒。 5 仪器设备、用具及试剂 5.1 仪器设备 酶标仪、洗板机、恒温水浴锅、普通冰箱(0℃~4℃)、-20℃低温冰箱、-80℃超低温冰箱、植物 光照培养箱(温度可调范围为0℃~50℃)、超净工作台、电子天平(1/10000g)、微量榨汁机、透射电子 显微镜、低速离心机(转速为3000r/min~5000r/min)、PCR仪、纯水仪、电泳仪、凝胶成像系统。 5.2 用具 可调微量移液器(2.5μL、10μL、100μL、1000μL、5000μL)和相应的吸头、酶联板、封口膜、pH 计或pH试纸条(广泛试纸和精密试纸)、1.5mL离心管、PCR反应管、容量瓶(500mL、1000mL)、解 剖刀片、镊子、剪刀、吸水纸、白瓷盘、记号笔、标签、一次性手套。 1GB/T28103—2011 5.3 试剂 双抗体夹心酶联免疫吸附测定的检测试剂(见附录B)。 反转录聚合酶链式反应检测试剂(见附录C)。 植物病毒免疫电镜检测试剂(见SN/T1840)。 6 现场检测 按照SN/T2122的规定进行检疫并抽取种子和种苗样品。 7 实验室检测 对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA),检验程序见附录B。 对样品进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定,检验程序见附录C。 对样品进行植物病毒免疫电镜(IEM)测定,检验程序见SN/T1840。在电镜下观察到弯曲线状病 毒粒子,测定其大小为15nm×700nm,病毒粒子周围有抗体晕圈,则IEM测定结果为阳性。否则IEM 测定结果为阴性。 8 结果判定 样品经过DAS-ELISA、RT-PCR测定或IEM测定,其两种或两种以上测定结果均为阳性,则判定 该样品带有小麦线条花叶病毒。否则判定样品不带有小麦线条花叶病毒。 9 样品保存与结果记录 9.1 样品保存 在适宜环境中保存已鉴定带有小麦线条花叶病毒的样品。如叶片应在超低温冰箱中单独保存或冻 干保存;生长的苗木应在植物光照培养箱中单独培育;种子应在干燥条件下保存。 9.2 结果记录与资料保存 记录各项数据,包括样品的种类、来源和样品状况,检测的时间、地点、方法和结果,测定人员的签 字。DAS-ELISA的测定结果应保存吸光值数据报告,RT-PCR测定结果应保存电泳照片,IEM测定结 果应保存病毒粒体照片。 2GB/T28103—2011 附 录 A (资料性附录) 小麦线条花叶病毒其他信息 A.1 形态学特征 病毒粒子形态为弯曲线状,无包膜,长690nm~700nm,直径11nm~15nm。 A.2 地理分布 最初报道于美国,目前在美洲、北非、中东、中亚、东亚、东南亚以及欧洲、澳大利亚均有发生。在我 国西北的甘肃、陕西等地区曾有发生。 A.3 寄主范围及症状 小麦线条花叶病毒侵染许多小麦品种以及燕麦、大麦、黑麦、一些玉米品种和黍,还侵染多种单子叶 杂草,但不侵染双子叶植物。 小麦线条花叶病毒引起小麦严重花叶和矮化症状。在小麦苗期,植株叶色变淡,叶片变窄,叶上出 现细小褪绿条点及黄色小点,与叶脉平行,并逐渐发展成苍白色断续条纹,部分组织坏死。苍白条纹不 规则愈合,在苍白背景的叶片上有残余绿色条纹,叶片是一侧向内纵向卷曲。新叶片上也有褪色条纹, 叶脉浊化稍暗。小麦拔节后,节间向下成弧状弯拐,节外复又向上,各节的向地一侧异常膨大造成全茎 呈拐节状,此症状在基部1节~3节最为明显。病情严重的植株,全株分蘖向四周匍匐,穗鞘扭卷,不易 抽穗或穗而不实。整个病田表现植株松散,外型异常。小麦线条花叶病毒对小麦产量影响大,轻者减产 30%~50%,重者颗粒无收。 诊断寄主:小麦、大麦、燕麦的所有品种和部分玉米品种表现系统花叶症状并且矮化。该病毒的某 些分离物侵染高粱(Sorghumbicolor)偶然出现坏死斑症状。 繁殖寄主:冬小麦任何品种都适于做该病毒的繁殖寄主。 测定寄主:没有合适的局部斑测定寄主。 A.4 分子生物学特性 小麦线条花叶病毒的核酸为单分子正义ssRNA,长为8.5kb,相对分子量为2.8×106,核酸占病毒 粒子质量约为5%。 小麦线条花叶病毒的基因组为单分体基因组,RNA的5’端为VPg,3’端为Poly(A)。基因组编码 一个344kDa的多聚蛋白,然后切割成10个产物,分别为40kDa的P1蛋白、44kDa的HC-Pro蛋白、 32kDa的P3蛋白、6kDa的6K1蛋白、73kDa的柱状内含体解旋酶、6kDa的6K2蛋白、23kDa的VPg、 26kDa的NIa蛋白、64kDa的NIb蛋白及30kDa的外壳蛋白。 3GB/T28103—2011 附 录 B (规范性附录) 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)方法检测 B.1 试剂 B.1.1 包被缓冲液(pH9.6) 碳酸钠(Na2CO3)1.59g,碳酸氢钠(NaHCO3)2.93g,叠氮化钠(NaN3)0.20g,溶解于900mL蒸 馏水中,用盐酸调节pH至9.6,用蒸馏水定容至1000mL。 B.1.2 PBST缓冲液(pH7.4) 氯化钠(NaCl)8.0g,磷酸二氢钠(KH2PO4)0.2g,磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.15g,氯化钾(KCl) 0.2g,0.5mLTween-20,叠氮钠(NaN3)0.2g,溶解于900mL蒸馏水中,用盐酸调节pH至7.4,蒸馏 水定容至1000mL。 B.1.3 样品抽提缓冲液 亚硫酸钠(Na2SO3)20g,2.0gPVP(MW24~4000),加PBST缓冲液1000mL。 B.1.4 酶标抗体缓冲液 20gPVP(MW24~4000),BSA2.0g,加PBST缓冲液1000mL。 B.1.5 底物缓冲液 二乙醇胺97mL,蒸馏水600mL,用盐酸调pH至9.8,然后用蒸馏水定容至1000mL。 B.1.6 底物ρNPP(对-硝基苯磷酸钠) B.1.7 种子表面消毒液 将30%次氯酸钠(NaClO)100mL溶于900mL蒸馏水中,制成3%种子表面消毒液。 B.1.8 生物制剂 小麦线条花叶病毒检测试剂盒(WSMV特异性抗体和酶标记抗体)。 小麦线条花叶病毒阳性质控。 小麦线条花叶病毒阴性质控。 B.2 DAS-ELISA检测 B.2.1 样品制备 B.2.1.1 种子类 随机抽取或针对性挑选100粒种子,浸入种子表面消毒液中消毒10min,用灭菌蒸馏水洗涤种子 三次。将种子摆放于铺有湿润吸水纸的白瓷盘内。在植物光照培养箱中,使种子在适宜的发芽温度 (20℃~28℃)下催芽长出叶片。 4GB/T28103—2011 用微量榨汁机研磨叶片并加入抽提缓冲液,样品质量与抽提缓冲液体积之比为1∶10。研磨的植 物汁液盛于离心管中,低速离心2min,上清液为待检样品液。 B.2.1.2 种苗类 随机抽取至少20株种苗的叶片0.2g,或针对性采集表现症状的病叶。用微量榨汁机研磨叶片并 加入抽提缓冲液,样品质量与抽提缓冲液体积之比为1∶10。研磨的植物汁液盛于离心管中,低速离心 2min,上清液为待检样品液。 B.2.2 检测步骤 B.2.2.1 在酶联板上设定待检样品孔和对照孔孔位。对照孔包括2个阳性质控孔、2个阴性质控孔、 2个空白对照孔。每个待检样品设定两个孔位。 B.2.2.2 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释WSMV包被抗体,每孔加入100μL抗体溶 液。用封口膜包好酶联板,水浴锅中37℃孵育2h或4℃冰箱过夜。 B.2.2.3 洗板机洗板3