ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28100—2011 香 石竹细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofBurkholderiacaryophylli (Burkholder)Yabuuchietal. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:邵秀玲、王有福、赵文军、甘琴华、厉艳、王英超、尼秀媚、粟智平、吴兴海、张治宇、 余冬冬。 ⅠGB/T28100—2011 香石竹细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了香石竹细菌性萎蔫病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于石竹属、满天星等植物种苗及产品中香石竹细菌性萎蔫病菌的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 SN/T1157 进出境植物苗木检疫规程 3 香石竹细菌性萎蔫病菌基本信息 中文名:香石竹细菌性萎蔫病菌。 学名:Burkholderiacaryophylli(Burkholder1942)Yabuuchietal.1993 Pseudomonascaryophylli(Burkholder1942)Starr&Burkholder1942 中文俗名:麝香石竹伯克霍尔德氏菌、石竹伯克霍尔德氏菌、红掌细菌性叶疫病 病害英文名:bacterialwiltofcarnation. 属原核生物界(Procaryotae)薄璧细菌门(Gracilicutes)暗细菌纲(Scotophobia)假单胞菌目(Pseud- omonadales)假单胞菌科(Pseudomonadaceae)伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)。 通过感染病菌的切割部分进行短距离传播。 香石竹细菌性萎蔫病菌基他信息参见附录A。 4 方法原理 经现场查验,实验室用显微镜、定量PCR仪等仪器设备对样品进行检测,根据病原菌的菌落特征、 菌体形态、生理生化特性及致病性测定和分子生物学检测结果进行判定。 5 仪器设备和用具 5.1 仪器设备 电子天平(感量0.0001g)、植物生长培养箱、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高压灭菌器、超净工作 台、生物显微镜(具照相系统)、高速冷冻离心机(12000r/min)、小型离心机、纯水仪、恒温水浴锅、低温 冰箱、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、电动搅拌器、真空冷冻干燥机等。 5.2 用具 培养皿、试管、可调式微量进样器(2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)及其枪头、研钵、 1GB/T28100—2011 离心管(1.5mL、1.0mL)、PCR管(0.2μL)、量筒、烧杯等。 6 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。 培养、鉴定香石竹细菌性萎蔫病菌所用培养基参见附录B。 7 检测鉴定 7.1 现场检疫 7.1.1 样品数量 按SN/T1157的规定执行。 7.1.2 症状观察 该菌侵染植株后,可在导管周围产生大量堵塞导管的赘生物,随之导致维管束变色,茎基部节间开 裂溃疡,切开病茎可见有棕黄色软泥状菌液溢出;感染病菌的植物叶片和茎呈灰绿色,叶片逐渐变黄枯 萎;严重者根茎部腐烂,直至植株枯萎死亡。症状显示后,植株一般会在1个~2个月内死亡,通过检查 成熟植株地上部分呈现出灰绿色症状很容易进行判断。 7.2 实验室检测鉴定 注:实验室检测鉴定流程图参见附录C。 7.2.1 样品初筛 通过肉眼或显微镜观察,对危害症状不明显的潜在感染可直接通过分子生物学检测进行样品初筛, 初筛阳性的样品需完成7.2.2~7.2.6的检测。 危害症状明显的样品需进行7.2.2~7.2.7的检测,30℃以上的培养条件可提高症状出现的速度。 7.2.2 病原菌的分离与培养 取可疑植物组织,75%酒精消毒,无菌水洗3次后,放在无菌的载玻片上用无菌的玻璃棒研碎,滴一 滴无菌水于研碎的病组织上。静置2min~5min后,用稀释法或无菌的移植环蘸取以上组织液在培养 基平板上划线,28℃培养24h~48h后,观察菌落生长情况。 7.2.3 菌落特征 病原菌在523培养基上呈圆形凸起,边缘整齐,透明,表面发亮,生长快,培养48h菌落直径2mm 左右(参见附录D);在NA培养基上生长缓慢;在King’sB培养基上,菌落黄色不透明,不产生荧光色 素。如果发现可疑菌落,需进行2次~3次菌种纯化。 7.2.4 形态特征 按GB/T4789.28中规定的方法进行革兰氏与鞭毛染色,显微镜观察菌体形态。 菌体杆状,少数呈丝状体,或稍弯曲的杆状,(0.35μm~0.95μm)×(1.05μm~3.18μm),菌体排 列方式多样,有链状条纹、并列排列或成堆状排列等多种排列方式,具有1至数根极生鞭毛,活动性好。 2GB/T28100—2011 7.2.5 生理生化 该菌好氧,无芽孢,可氧化分解单糖、双糖、多糖,并可利用唯一的碳源和氮源,为致病菌。按 GB/T4789.28规定的常规方法、生化管或BIOLOG微生物鉴定系统等辅助进行生理生化特性测定(见 表1)。 表1 B.caryophylli鉴定常用的生理生化特征表 生理生化特征 香石竹细菌性萎蔫病菌(B.caryophylli) 革兰氏染色 - 接触酶 + 氧化酶 - 反硝化 + 硝酸盐还原 + 精氨酸双水解酶 + 葡萄糖氧化发酵 + 明胶水解 - 淀粉水解 - 甲基红试验 - V-P试验 - 最适生长温度(℃) 28 注:+:90%以上菌株为阳性;-:90%以上菌株为阴性。 7.2.6 致病性测定 将纯化培养48h的菌株用无菌水配成106CFU/mL~108CFU/mL的菌悬液,用注射法接种于 5叶龄~6叶龄幼嫩的香石竹根茎部,无菌水作阴性对照,标准菌株作阳性对照,30℃~33℃保湿培养 48h,10d~14d左右观察病菌侵染症状。如果产生典型的症状,表明所分离的菌株具有致病性,需要 从接种植株上再次分离病菌,再分离的纯菌株应具有与原菌株一致的病原特征,否则判定所分离的菌株 不具有致病性。 7.2.7 PCR法检测 PCR检测实验方法见附录E。 8 结果判定 8.1 无症状植物 对无症状的植物体直接进行分子生物学检测进行初筛,如果检测结果为阴性,实验最终判定为阴 性,如果检测结果为阳性,需完成7.2.2~7.2.6的检测,进一步进行结果判定。 8.2 有症状植物 对有症状的植物体需进行病菌分离,如果所分离的菌株在培养基上的菌落特征、生理生化特性与标 3GB/T28100—2011 准相符,且菌株致病性测定为阳性,可以初步判定待检菌株为香石竹细菌性萎蔫病菌,需做分子生物学 方法进行确认,如果PCR检测结果为阳性,可以最终判定为检出香石竹细菌性萎蔫病菌,否则结果判定 为阴性。 9 菌株保存 从检测样品中分离到并鉴定为香石竹细菌性萎蔫病菌的菌株,应妥善保存。将菌株转接到试管斜 面上,28℃恒温培养48h。然后置于4℃冰箱中保存,定期(30d~60d)转接,防止病菌死亡;或在菌悬 液中加入15%~30%的甘油于-80℃下保存;必要时将菌株用真空冷冻干燥机制成冻干粉,-80℃下 长期保存。 4GB/T28100—2011 附 录 A (资料性附录) 香石竹细菌性萎蔫病菌的相关资料 A.1 地理分布 中国(吉林、云南西双版纳、台湾)、印度、以色列、日本、奥地利、保加利亚、丹麦、法国、德国、匈牙利、 爱尔兰、意大利、荷兰、奥地利、波兰、塞尔维亚、挪威、波兰、斯洛伐克、瑞士、英国、南斯拉夫、加拿大、美 国(佛罗里达州、伊利诺斯州、印地安那州、爱荷华州、马萨诸塞州、明尼苏达州、密苏里州、蒙大拿州、宾 夕法尼亚州、纽约、华盛顿)、阿根廷、巴西、哥伦比亚、乌拉圭 A.2 寄主范围 该病菌自然侵染的寄主有:麝香石竹Dianthuscaryophyllus、美国石竹Dianthusbarbatus、中华 (波状)补血草Limoniumsinuatum、满天星Gypsophilapaniculata等。 A.3 病原菌形态特征生物学特性 该菌通过伤口进入植物体,随后侵染根茎的维管束,温度高于20℃可加速细菌生长及植物体症状 显示,低温条件下感病植物不显示症状。植物体在轻微感染、低温保存的条件下,病菌可潜伏2年~ 3年才呈现症状,土壤温度低于17℃时,菌体细胞的快速繁殖造成对茎部导管的压力加大,通常在植物 基部节间出现开裂,接着发展为溃疡。这种开裂与某几个栽培变种的生理开裂很相似,但病源开裂可见 到有棕黄色菌液溢出,溃疡处会出现由腐生真菌引起的畸形生长,茎部形成空洞;在20℃~25℃条件 下,多为枯萎症状,少见溃疡,剥落的茎粘稠、棕黄色、宽窄不定,导管组织有纵向条纹,交叉处有不规则 的水浸状褐色斑点;尽管低于20℃的情况下茎开裂的状况很普通,但高于30℃的条件下萎蔫症状很 明显。 A.4 传播途径 病菌可通过带菌水侵染植物切口,主要的传播途径是通过感染病菌的切割部分,该部分携带病菌菌 源主要来自尚无症状显示的带菌母体,在自然条件下病菌