ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28099—2011 水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofXanthomonasoryzaepv.oryzicola(Fangetal.) Swingsetal. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前　　言 　　本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫 局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、南京农业大学。 本标准主要起草人:易建平、林石明、周国梁、粟寒、印丽萍、孔德英、许志刚、胡白石。 ⅠGB/T28099—2011 水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法 1　范围 本标准规定了水稻细菌性条斑病菌的检测和鉴定方法。 本标准适用于水稻种子及植株上水稻细菌性条斑病菌的检测与鉴定。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T0800.1　进出口粮油、饲料检验　抽样和制样方法 SN/T2122　进出境植物及植物产品检疫抽样 3　水稻细菌性条斑病菌基本信息 中文名:水稻细菌性条斑病菌(稻黄单胞菌稻生致病变种)。 学名:Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Fangetal.,1956)Swingsetal.,1990,简称Xoc。 异名:Xanthomonascampestrispv.oryzicola(Fangetal.,1956)Dye1978;Xanthomonas oryzicola(Fangetal.,1956)Dowson1943;Xanthomonastranslucensf.sp.oryzicola(Fangetal., 1956)Bradbury1971。 病害英文名:bacterialleafstreakofrice。 属细菌界Bacteria,变形细菌门Proteobacteria,γ-变形细菌纲Gammaproteobacteria,黄单胞菌目 Xanthomonodales,黄单胞菌科Xanthomonodaceae,黄单胞菌属Xanthomonas(Dowson,1939)。 病菌主要在病种子和病草上越冬,其次在水稻再生苗或李氏禾等杂草上越冬。病菌主要借雨水、流 水等传播,带菌种子是远距离传播的主要途径之一。 水稻细菌性条斑病菌的其他信息参见附录A。 4　方法原理 根据症状特征、菌落形态特征、生理生化特征、PCR反应和致病性测试结果等进行检测鉴定。 5　主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。 三羟甲基胺基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基 三甲基溴化胺(CTAB)、三氯甲烷、异戊醇、乙醇、蛋白酶、溴化乙锭、酵母粉、琼脂、蛋白胨、牛肉浸膏、营 养肉汤、葡萄糖、蔗糖、谷氨酸钠。 培养基和试剂配方见附录B。 1GB/T28099—2011 6　仪器用具 超净工作台、高压灭菌锅、生物显微镜、培养箱、电子天平、冰箱、离心机、水浴锅、培养皿、三角瓶、剪 刀、电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定系统、微量可调加样器和离心管。 7　检测与鉴定 7.1　现场检疫 按照SN/T2122和SN/T0800.1规定的程序进行现场检疫并抽取样品。 7.2　实验室检测 7.2.1　有症叶片的分离 有症叶片用无菌水冲洗后取病斑前沿2mm~7mm部分用70%酒精表面消毒15s,无菌水洗三次 后用无菌剪刀剪碎,置于无菌载玻片上,加一滴无菌水,不加盖玻片,置于显微镜下观察喷菌现象,如观 察到喷菌现象,从喷菌处用接种环取一环处理液在NA(PSA或NBY)培养基平板上划线分离,重复3个 平板,27℃培养3d~5d。 7.2.2　无症叶片的分离 取10张无症叶片,剪碎研磨后提取DNA,进行PCR检测,DNA提取程序和PCR检测程序见附 录C。阳性样品进行病菌分离。另取无症叶片10张,无菌水冲洗叶面,70%酒精表面消毒15s,无菌水 洗三次后用无菌剪刀剪碎,加入适量无菌水,静置15min,用接种环取处理液在NA(PSA或NBY)培养 基平板上划线分离,重复3个平板,27℃培养3d~5d。 7.2.3　从种子中分离 种子处理液在培养基上富集后进行PCR检测,100g种子磨碎后置于200mL含有0.01% Tween20的无菌水中4℃过夜,取100μL处理液在PSA培养基平板上涂布,重复3个平板,27℃培养 2d,每个平板用1mL无菌水洗下,取洗板液用于PCR检测,阳性样品进行病菌分离。取种子处理液 1mL在无菌水中系列稀释三次,分别取稀释和未稀释的处理液100μL在NA(PSA或NBY)培养基平 板上划线分离,重复3个平板,27℃培养3d~5d。 7.3　鉴定方法 7.3.1　形态特征鉴定 NA培养基上菌落平滑,不透明,有光泽,圆形,凸起,边缘完整;初始为白色,后变为浅黄色;NBY 培养基上的菌落浅黄色,圆形,凸起,粘液状;PSA培养基上菌落浅黄色,粘液状,有光泽。挑取可疑菌 落在NA培养基平板上纯化三次后进行鉴定。 7.3.2　生理生化鉴定 病菌能使明胶液化,使石蕊牛乳胨化,使阿拉伯糖产酸;不还原硝酸盐,产生氨和硫化氢;不产生吲 哚;可分解蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖和乳糖等产生酸,但不产生气体;对青霉素、葡萄糖反应钝感。也可 用BIOLOG微生物自动鉴定系统进行鉴定。 2GB/T28099—2011 7.3.3　PCR方法鉴定 制备分离物108CFU/mL细菌悬浮液,1mL菌悬液提取DNA后进行PCR检测,检测程序见附 录C。 7.4　致病性测试 三种鉴定方法之一为阳性的分离物进行致病性测试。30d~45d龄期大小的IR24或汕优63种植 在12h光照/黑暗的循环条件下,最适温度为28℃~32℃/22℃(白天/夜晚)。用无菌生理盐水配制 108CFU/mL细菌悬浮液,无菌接种针蘸取菌液后针刺接种于叶片中部,每张叶片针刺两个点,共接种 30张~40张叶片。接种植株用塑料袋保湿24h,12h光照/黑暗的循环条件下30℃培养,接种48h~ 72h后观察症状,最长至14d。初始症状为接种点出现红色条斑,通常10d后显症,病斑边缘为线条 形,沿叶脉扩展。如果产生典型症状,从接种病斑上再次分离病菌,培养基上形态特征相符或PCR检测 为阳性即可认为接种分离物为水稻细菌性条斑病菌。 8　结果判定 从样品中分离得到的可疑分离物用形态特征,生理生化或PCR检测等三种方法之一进行鉴定;阳 性分离物进行致病性测试,出现典型症状,判定为检测出Xoc;其余情况判定为未检出Xoc。 9　样品保存 阳性种子样品至少保存6个月,至少1000粒,以备复核、谈判和仲裁;阳性的植物材料及时销毁处 理;分离菌株应妥善保存,将菌株转接到NA试管斜面上,28℃培养48h。然后置于4℃冰箱中保存,定 期(30d)转接;或在菌悬液中加入15%~30%甘油于-80℃下保存;必要时可将菌株冻干,-80℃下长 期保存。 3GB/T28099—2011 附　录　A (资料性附录) 水稻细菌性条斑病菌其他信息 A.1　检疫重要性 《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》(2007年)中的检疫性有害生物之一,目前国内受 害病区已超过11个省。欧洲和地中海国家植物保护组织(EPPO)的A1类检疫性有害生物。目前分布 于热带亚洲地区、西非和澳大利亚等地。 A.2　寄主植物 主要寄主是水稻Oryzasativa;其他寄主包括:稻属Oryzaspp.,李氏禾属Leersiaspp.,丝千金子 Leptochloafiliformis,圆果雀稗Paspalumorbiculare,茭白Zizaniaaquatica,沼生菰Z.palustris和结 缕草Zoysiajaponica。 A.3　形态特征 病菌为革兰氏染色阴性,短杆状,大小(0.4μm~0.6μm)×(1.1μm~2.0μm);无芽孢和荚膜,菌 体外具粘质的胞外多糖包围;单生,很少成对,不呈链状;极生鞭毛一根。最适生长温度25℃~28℃, 生长温限8℃~38℃。 A.4　症状特征 整个水稻生育期的叶片均可受害。病菌进入气孔在叶片薄壁组织内繁殖,主要感染叶片薄壁组织 细胞,局部侵染。病斑初呈暗绿色水渍状半透明的小点,渐形成叶脉间透明条斑,限在叶脉之间延伸,颜 色由黄褐转橙褐色,这种透明条斑与白叶枯病的不透明症状差异明显。病斑上常泌出许多露珠状的蜜 黄色菌脓(参见图A.1)。病情严重时,许多条斑融合、连接在一起,成为不规则的黄褐色至枯黄色斑块, 此时病叶枯萎,变褐,最后死亡,后期的症状与白叶枯病有些相似(参见图A.2)。 4GB/T28099—2011 图A.1　叶片症状 图A.2　田间症状 5GB/T28099—2011 附　录　B (规范性附录) 培养基和试剂配方 B.1　NA培养基 蛋白胨5g,牛肉浸膏3g,琼脂18g,加蒸馏水至1000mL,pH6.8~7.0,121℃湿热灭菌15min。 B.2　NBY(NutrientBrothYeastExtractAgarMedium)培养基 Sol.1:营养肉汤8g;酵母粉2g;