ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28096—2011 木薯细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofXanthomonasaxonopodispv.manihotis (Bondar)Vauterinetal. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前　　言 　　本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国海南出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫 局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:李伟东、封立平、刘福秀、韩玉春、周先超、粟寒、吴翠萍、王英超。 ⅠGB/T28096—2011 木薯细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法 1　范围 本标准规定了植物检疫中木薯细菌性萎蔫病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于木薯种子、苗木、种茎和其他繁殖材料中木薯细菌性萎蔫病菌的检疫鉴定。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T4789.28　食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 3　木薯细菌性萎蔫病菌基本信息 中文名:木薯细菌性萎蔫病菌(地毯草黄单胞杆菌木薯致病变种)。 学名:Xanthomonasaxonopodispv.manihotis(Bondar)Vauterin,Hoste,Kersters& Swings1995。 异名:BacillusmanihotisArthaud-BerthetandBondar1912,Phytomonasmanihotis(Berthetand Bondar)Viegas,Xanthomonasmanihotis(BerthetandBondar)Starr1946,Xanthomonas.campestris pv.manihotis(ArthaudandBondar)Dye1978。 病害英文名:bacterialblightofcassava,cassavabacterialblight。 属原核生物界Procaryotes、变形细菌门Proteobacteria、γ-变形细菌纲Gammaproteobacteria、黄色 单胞菌目Xanthomonadales、黄色单胞菌科Xanthomonadaceae、黄色单胞菌属Xanthomonas、地毯草黄 单胞杆菌Xanthomonasaxonopodis。 病菌的远距离传播主要靠带菌种子、苗木和种茎。绝大多数木薯病种子不表现任何症状,病菌以休 眠状态存在于种子的胚部和种皮。 木薯细菌性萎蔫病菌的其他信息参见附录A。 4　方法原理 该病害症状、病菌生物学特性、生理生化特性、致病性测试和基因组DNA的特异性PCR检测是该 病菌检测鉴定的依据。 5　仪器和用具 5.1　仪器 电子天平、实体显微镜、超净工作台、温控培养箱、高压灭菌锅、微生物自动鉴定系统、PCR仪、电泳 仪、紫外检测仪或凝胶成像系统、离心机、恒温水浴锅(30℃~95℃)、超低温冰箱、普通冰箱、纯水机、涡 旋振荡器、可调微量加样器。 1GB/T28096—2011 5.2　用具 解剖刀、裁纸刀、量筒、烧杯、培养皿、三角瓶、离心管、放大镜、手术剪、镊子、接种环等。 6　化学试剂 6.1　试剂 次氯酸钠(NaClO)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、70%乙醇、吐温-60、吐温-80、淀粉、蔗糖、葡萄糖、果 糖、海藻糖,PCR检测所需试剂(参见附录B)。 6.2　培养基 CTA和LPG培养基及配制(见附录C)。 7　检测鉴定 7.1　症状检查 首先观察植株是否萎蔫,接着仔细检查植株的嫩芽、茎、叶等各个部位,嫩芽、叶是否出现凋萎;叶片 是否出现水渍状,暗绿色多角形的小斑,褐色或深褐色由黄晕围绕的不规则形的病斑,凋萎,干枯脱落; 嫩茎和叶柄是否有水渍状,黑褐色下陷的病斑;横切茎干,检查其维管束组织是否变褐坏死、病部受挤压 后是否有菌脓溢出。 7.2　快速初筛 对出现典型症状的植株直接进行病菌分离;对症状不典型或不明显的木薯种子、苗木和种茎应用 PCR法进行快速初筛。 从植物组织(种子或叶片或种茎)中抽提总核酸,用木薯细菌性萎蔫病菌标准菌株作阳性对照,用地 毯草黄单胞杆菌其他致病变种的标准菌株和健康植株抽提总核酸作阴性对照,用超纯水作为空白对照, 进行PCR(方法步骤见附录C)检测分析。若PCR检测结果为阳性,继续进行7.3;若PCR检测结果为 阴性,则可判定为未检出。 7.3　病菌分离 7.3.1　种子带菌的分离 称取木薯种子样品20g,置于1%次氯酸钠溶液浸泡消毒2min~4min,无菌水洗涤三次,然后将种 子磨碎,装入一灭菌的三角瓶中,加入100mL灭菌的0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液,混匀,25℃下静置 过夜,次日用该溶液在事先制备好的CTA平板培养基上划线,30℃恒温培养48h后,检查并筛选培养 基上的菌落。 7.3.2　病组织(病叶或茎段)中病菌的分离 将病组织切成3mm见方的小块,先用70%乙醇浸泡30s,捞出后用1%次氯酸钠溶液浸泡2min, 再用无菌水洗涤三次,最后把病组织置于消毒的小培养皿(直径6cm)中,加几滴无菌水,捣碎,静置 10min~15min,制成悬浮液,用接种环蘸取汁液在CTA平板上划线,30℃下培养2d后,检查并筛选 培养基上的菌落。 2GB/T28096—2011 7.3.3　形态特征 病菌为革兰氏阴性,菌体短杆状,大小(0.3μm~0.4μm)×(1.1μm~1.2μm),多数单个排列,少 数3个~4个连接成短链。不产生芽孢,无荚膜。鞭毛单根极生。在CTA培养基上生长的菌落呈灰白 色到奶油色,隆起,光滑,有光泽,边缘整齐,培养2d菌落直径可达1mm。开始时菌落透明,渐渐混浊 不透明,最后变成表面有一层粘质的固体物。在LPG平板上恒温(27℃~28℃)培养5d,菌落突起,表 面光滑,乳白色,有光泽,菌落边缘完整,直径3mm~5mm,粘稠。 如果发现可疑的菌落,采用平板划线法,即用灭菌的接种环蘸取CTA平板上菌落后,在LPG平板 上多次划线纯化,在30℃下恒温培养2d~4d,纯化三次后进行鉴定。 7.4　革兰氏染色 按GB/T4789.28中2.2的方法进行革兰氏染色反应。若染色结果为革兰氏阴性菌,则进行下一 步检测。 7.5　生理生化指标测定 结合实验条件对分离菌株进行生理生化指标测定。 应用微量发酵管对分离菌株进行生理生化指标的测定。若分离菌株能水解吐温-60、吐温-80、淀 粉、蔗糖、葡萄糖、果糖和海藻糖,液化明胶,强烈水解卵磷脂,使石蕊牛乳产碱、胨化,则生理生化指标测 定结果为阳性。 应用微生物自动鉴定系统对分离菌株进行生理生化指标的测定。按照微生物鉴定系统规定的操作 方法进行,鉴定结果为木薯细菌性萎蔫病菌,则判定该分离菌株的微生物鉴定系统的鉴定结果为阳性。 7.6　PCR检测 取经分离纯化的细菌菌落,配备1×108CFU/mL的细菌悬浮液,进行PCR检测,无需抽提总核酸。 检测方法步骤见附录C。 7.7　致病性测定 将在LPG培养基上培养48h后的菌株,配成1×108CFU/mL的细菌悬浮液,采用针刺接种法,用 消毒的接种针蘸上细菌悬浮液,针刺木薯植株的第三片、第四片叶和嫩茎等,每一菌株接种5株,阴性对 照用无菌水代替接种液。接种后的植株置放于人工气候箱,在28℃~32℃温度下,先在100%相对湿 度保湿24h~48h,然后在80%左右的相对湿度下,每天在7000lx~10000lx下光照培养16h,黑暗下 培养8h。接种7d后开始观察症状,每天观察一次,连续观察30d。植株上的叶片出现黑绿色到蓝色 水渍状不规则斑(直径1cm~4cm),病斑迅速扩展并且不规则形斑沿着叶脉和叶片边缘结合在一起, 对着光线可看到半透明的斑,叶片感病部分周围变成亮褐色;整株植物表现出萎蔫、在茎横切面出现褐 变且挤压有菌脓溢出的视为发病,表明从种子或植株或种茎上分离到的菌株具有致病性,而且需要从接 种病斑上再次分离出来;不表现症状的接种植株视为不发病。 8　结果判定 若植株呈现典型症状,或初筛PCR检测结果为阳性,要对可疑样品进行病菌的分离;根据分离菌株 在培养基上的形态特征,确定可疑菌落,至少采用一种方法(生理生化指标测定和分子检测方法)对可疑 菌落进行鉴定,最后进行寄主的致病性测定以确诊。如果一种或一种以上鉴定方法为阳性,且致病性测 定表现为典型症状,则判定为检出木薯细菌性萎蔫病菌;如果任一种鉴定方法都为阴性,则判定为未检 3GB/T28096—2011 出木薯细菌性萎蔫病菌。 9　样品和菌种保存 9.1　样品保存 样品(种子或植株或种茎)拍照后均应制成干标本,经登记和签字后置于阴凉干燥、防虫防鼠处妥善 保存3个月。对鉴定为木薯细菌性萎蔫病菌的样品至少应保存6个月,以备复检、谈判和仲裁,样品保 存期满后,需经灭菌处理。 9.2　菌种保存 从样品中分离并鉴定为木薯细菌性萎蔫病菌的菌株应转接到试管斜面,经登记和签字后置于4℃ 冰箱中保存,定期转接;或病菌悬浮液加60%甘油置于超低温冰箱(-70℃)长期保存,或用真空干燥机 制成病菌冻干粉置于超低温冰箱(-70℃)长期保存。 4GB/T28096—2011 附　录　A (资料性附录) 木薯细菌性萎蔫病菌其他信息 A.1　地