ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28095—2011 木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPhellinusnoxius(Corner)G.Cunn. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前　　言 　　本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国宁波出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国江苏 出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:张建成、陈先锋、丁国云、张慧丽、戴忠军、张培、王良华。 ⅠGB/T28095—2011 木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法 1　范围 本标准规定了木层孔褐根腐病菌Phellinusnoxius的检疫鉴定方法。 本标准适用于木材和苗木上的木层孔褐根腐病菌的检测和鉴定。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T12728　食用菌术语 SN/T1126　进出境木材检疫规程 SN/T1157　进出境植物苗木检疫规程 3　术语和定义 GB/T12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 平伏反卷　effused-reflexed 担子果在基物上的着生形态,其一部分贴附于基物上,边缘翘起反卷形成檐状、条状、半圆形或扇形 菌盖,有时呈覆瓦状叠生。整个担子果贴附于基物上,不形成菌盖的形态称为平伏(effused)。 3.2 生殖菌丝　generativehyphae 担子果中基本的菌丝类型。在刺革菌科(Hymenochaetaceae)种类中,生殖菌丝只形成简单分隔, 不形成锁状联合,通常无色、浅黄色或浅黄褐色,薄壁或厚壁,分枝或很少分枝。 3.3 刚毛状菌丝　setalhyphae 在菌肉或菌髓中形态像菌丝,但明显比菌丝宽,且具有厚壁,顶端尖锐的结构。 4　木层孔褐根腐病菌基本信息 中文名:木层孔褐根腐病菌。 学名:Phellinusnoxius(Corner)G.Cunn.1965。 异名:FomesnoxiusCorner1932;Phellinidiumnoxium(Corner)Bondartseva&S.Herrera1992。 病害英文名:brownrootrotdisease。 属真菌界Fungi,担子菌门Basidiomycota,担子菌纲Basidiomycetes,刺革菌目Hymenochaetales, 刺革菌科Hymenochaetaceae,木层孔菌属Phellinus。 木层孔褐根腐病菌的其他信息参见附录A。 1GB/T28095—2011 5　方法原理 根据木层孔褐根腐病菌在寄主植物上的症状,抽取可疑样品进行病原菌分离培养,根据病原菌的形 态特征、生物学特征和PCR特异性反应对病菌进行鉴定。 6　仪器和用具 6.1　仪器设备 体视显微镜、显微镜(具100×油镜和测微尺)、超净工作台、生物培养箱、冰箱、高压灭菌器、干热灭 菌器。 6.2　实验用具 载玻片、盖玻片、滴管、培养皿、镊子、解剖刀、酒精灯、医用手术剪。 7　试剂和材料 7.1　试剂 7.1.1　蒸馏水(H2O)。 7.1.2　5%氢氧化钾(KOH)溶液(质量浓度)。 7.1.3　棉蓝试剂:棉蓝(苯胺蓝)0.5g、乳酸60mL。 7.1.4　Melzer试剂:碘(I2)0.5g、碘化钾(KI)1.5g、水20g、水合氯醛22.5g。 7.2　培养基 7.2.1　大麦提取物琼脂(MEA)培养基 大麦提取物(MaltExtract)20g,琼脂(Agar)20g,加蒸馏水至1000mL。121℃高压湿热灭菌 30min,倒平板备用。 7.2.2　选择性培养基 MEA培养基灭菌后,待冷却至40℃~50℃,加入100mg氨苄青霉素,10mg氯硝胺,10mg苯菌 灵,500mg没食子酸,混匀倒平板。 7.2.3　马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基 自行配制或使用市售PDA培养基。 8　现场检测 取样和抽样按照SN/T1157或SN/T1126方法进行。 取样时应进行针对性检查,检查有无可疑症状,重点观察茎干基部1m范围内区域及根系是否包裹 褐色菌丝层;剥去树皮,观察树木组织是否白色腐朽,有无褐色网纹状菌丝束;腐烂树木表面是否有真菌 子实体。直接挑出带有可疑症状的货物,将可疑部分切(锯)下,送实验室作进一步检验鉴定。 2GB/T28095—2011 9　实验室检测 9.1　分离和培养 将带病材料用自来水冲洗干净,洁净吸水纸吸干。去除树皮,用消毒的解剖刀片将内部病组织切成 约3mm×3mm×6mm小块,置于选择性培养基平板上,每个培养皿放置5块,梅花状排列,30℃黑暗 培养5d~10d。选择性培养基上的褐色菌落转移到MEA培养基或PDA培养基30℃黑暗培养。长满 平板后,检查培养性状,在光学显微镜下观察菌丝形态特征。 9.2　子实体观察 如发现病菌子实体,采用宏观形态观察和显微切片方法检测。 宏观形态观察使用体式显微镜,观察子实体的形态、色泽、菌盖、菌孔等特征。 显微切片检测方法,使用干标本制作成徒手切片,以蒸馏水、Melzer试剂和5%氢氧化钾溶液分别 做为浮载剂,在显微镜下观察菌丝及子实层中的担孢子、担子、菌髓等微观特征。显微测量和摄像均在 棉蓝试剂包埋的切片中进行。孢子测量30个,其他结构如菌丝直径、担子大小等均测量10个,取极小 值与极大值,宽度测量于其结构的最宽部位,长度测量于其顶端至基部分隔处。 9.3　PCR检测方法 培养物菌丝或病组织中病菌DNA提取和PCR检测方法见附录B。 引物PN-1F/PN-2R扩增病菌DNA,得到414bp或422bp扩增产物,则为PCR检测阳性,反之,为 阴性。所有真菌DNA均可与通用引物ITS-1和ITS-2结合扩增产生300bp左右的DNA片段。 10　鉴定特征 10.1　寄主上症状 树木根和茎基部表面多形成一层厚厚的黑褐色到黑色菌丝壳,坚硬,油浸状表面,根部菌丝壳常与 泥沙结合不明显。潮湿时,茎部菌丝壳的延伸边缘乳白色,约2cm宽,带有澄清褐色的渗出液滴。(参 见图C.1)树皮易剥落,病害引起软而脆的蜂窝状白色腐烂,受感染树皮内侧组织具不规则暗褐色菌丝 束形成的网纹(参见图C.2)。 10.2　无性阶段特征 10.2.1　培养性状 在含有没食子酸MEA培养基上,能产生扩散性的暗褐色色素。菌落不规则,菌落前缘菌丝气生至 平伏,初始白色至草黄色,渐渐转为黄褐色至褐色,有褐色网纹(参见图D.1)。 10.2.2　显微特征 菌丝透明到褐色,不产生锁状联合,一般能够产生节孢子和毛状菌丝。节孢子(参见图D.2)由菌丝 断裂形成,与菌丝同色,球形到卵形。毛状菌丝(参见图D.3)鹿角状,菌丝分叉生长,表面有刺状突起。 10.3　子实体形态 10.3.1　整体特征 子实体单生,无柄,大小不一,平伏或平伏反卷形成窄的菌盖(参见图C.3和图C.4),长可达10cm, 3GB/T28095—2011 宽可达6cm,基部厚可达2.5cm;平伏时长可达40cm,宽可达15cm。新鲜时硬革质或软木栓质,无嗅 无味,干后硬木质。菌盖表面暗褐色至黑色,具不规则的环带,光滑。孔口表面灰褐色至暗褐色,不育的 边缘明显,孔口圆形,每毫米7个~8个,孔口边缘薄而全缘。 10.3.2　微观结构 子实体切片分为3部分,最上层表皮为一明显的黑色薄皮壳,中间菌肉层,下层菌管层。菌肉黄褐 色,具同心环带,菌肉和菌管之间有一条黑色细线相间。菌管褐色。微观结构参见图D.4。具体结构 如下: a)　菌丝结构:担子果内只存在生殖菌丝;菌肉中菌丝为菌肉菌丝,菌管为子实层体,其中的菌丝为 菌髓菌丝,菌髓菌丝与菌肉菌丝相似;所有隔膜无锁状联合;在5%KOH试剂中菌丝组织颜 色变黑,对Melzer试剂无变色反应,在棉蓝试剂中略变蓝色。担子果菌髓里的刚毛状菌丝顶 端钝而菌肉里的刚毛状菌丝顶端锐,是子实体的最重要的鉴定特征。 b)　菌肉:生殖菌丝无色,薄壁,偶尔分枝,常具隔膜,平直,规则排列,直径为4μm~7μm;刚毛状 菌丝褐色至暗褐色,厚壁,内腔宽,通常末端尖,起源于黄色厚壁菌丝,长达数百微米,直径 5μm~10μm。 c)　菌管:生殖菌丝很少分枝,常具隔膜,略平行排列,相互紧密黏结,直径为3μm~6μm。刚毛状 菌丝明显,厚壁并具一狭窄的内腔,顶端圆钝,长达数百微米,最宽处直径为7μm~14.5μm。 子实层通常在后期消解;囊状体棍棒状,具长而尖锐的顶部,薄壁,大小为(16μm~21μm)× (4μm~5μm);担子近棍棒状,大小为(12μm~16μm)×(3.5μm~4μm);次生菌丝丰富,无 色,薄壁,常分枝,直径为3μm~5μm。 d)　孢子:担孢子椭圆形或倒卵形,无色,薄壁,大小为(4μm~6μm)×(3μm~5μm)。 10.4　木层孔褐根腐病菌与其近似种的主要区别 木层孔褐根腐病菌与其近似种橡胶木层孔菌的主要区别参见附录E。 11　结果判定 11.1　检出子实体,符合10.3的鉴定特征,可直接判为木层孔褐根腐病菌。 11.2　未检出子实体,为害症状、无性阶段培养特征符合10.1~10.2鉴定特征,判为木层孔褐根腐 病菌。 11.3　未检出子实体,为害症状不明显,分离得到符合10.2鉴定特征的真菌,PCR特异性反应阳性,可 判为木层孔褐根腐