ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28093—2011 马 铃薯银屑病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofHelminthosporiumsolaniDur.&Mont. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:刘伟、严进、王秀芬、董薇、姜丽、王有福、丘驰、陈嵘、赵文军、朱水芳、张秋娥。 ⅠGB/T28093—2011 马铃薯银屑病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了马铃薯银屑病菌的检疫和鉴定方法。 本标准适用于马铃薯块茎上马铃薯银屑病菌的检疫和鉴定。 2 马铃薯银屑病菌基本信息 学名:HelminthosporiumsolaniDur.&Mont. 中文名:马铃薯银屑病菌(茄长蠕孢菌)。 英文名:potatosilverscurf。 根据《DictionaryofFungi》第9版,马铃薯银屑病菌(HelminthosporiumsolaniDur.&Mont.)的 分类地位为:真菌界(Fungi),有丝分裂孢子真菌(Mitosporicfungi)的长蠕孢属,茄长蠕孢菌。 3 方法原理 马铃薯银屑病菌在马铃薯块茎上具有银色光泽的病斑及经过保湿培养后形成独有的“圣诞树”状孢 子梗和分生孢子是马铃薯银屑病菌鉴定的依据。 4 主要仪器设备、用具和试剂 4.1 仪器设备:体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、生物培养箱、光照培养箱、电子天平、高压灭菌 锅等。 4.2 用具:培养皿、烧杯、白瓷盘、尖头镊子、载玻片、盖玻片、量筒、酒精灯等。 4.3 试剂:PDA培养基(可选用市售PDA培养基)、次氯酸钠、无水乙醇等。 5 现场检疫 5.1 抽样 5.1.1 抽样方法 以批号为抽样单位,无批号的以品种为抽样单位随机抽取。每份样品的抽样点不少于5个(对于散 装的马铃薯,应在表层以下0.3m取样更为适宜)。单位包装只能有一个抽样点。 5.1.2 抽样数量 500粒以下取1份;501粒~2000粒取2份;2001粒~5000粒取3份;5001粒~10000粒取 4份;10001粒以上,每增加10000粒增取1份,不足10000粒的余量,计取1份。 每份样品20粒块茎。 1GB/T28093—2011 5.2 现场查验 按进出境马铃薯种薯总件数的5%~20%随机抽检,最低抽检数量不少于10件,且不少于 1000粒。 现场检查马铃薯块茎是否有马铃薯银屑病菌侵染后的典型症状(见7.1)。将现场查验发现的有马 铃薯银屑病菌的典型症状块茎用塑料袋装好,连同现场抽取的样品分别加贴标识后送实验室进行进一 步的分离和病原鉴定,并做好现场查验记录。 6 实验室检验 6.1 马铃薯块茎症状检验 将现场抽取的马铃薯块茎样品混匀,从中随机抽取100个块茎进行检查。检查是否有马铃薯银屑 病菌侵染的症状,如果发现可疑症状连同现场查验的可疑块茎按6.2和6.3进行分离培养。 6.2 马铃薯块茎保湿培养 取25个~50个典型症状的块茎样品,先用自来水冲洗,再用灭菌水冲洗后放入装有湿纸巾的塑料 袋中,封口后,在塑料袋上打几个0.16cm直径的小孔,在黑暗中保持在22℃±2℃,培养2周~3周。 周期性地湿润纸巾,避免马铃薯块茎干燥。 6.3 PDA培养 在马铃薯块茎表面的病斑处,切取7mm直径的小块,用1.0%次氯酸钠消毒30s,用灭菌的蒸馏水 冲洗两次,灭菌滤纸吸干水分,放置在PDA培养基(见附录A)上,在22℃±2℃条件下培养2周~ 3周。 7 鉴定特征 7.1 马铃薯块茎症状特征 7.1.1 块茎上病斑症状 马铃薯银屑病菌主要侵染马铃薯块茎,在马铃薯周皮上形成圆形的病斑,病斑褐色至灰色。病斑深 度多局限在周皮,不扩展到块茎内部,病斑最终表现为银色(参见图B.1、图B.2)。在储藏期,被侵染的 薯块表皮最终表现为皱缩的特征,由于受伤表皮过度水分蒸发,使病斑最终表现为褐色,部分周皮可能 脱落。 7.1.2 块茎上病原菌特征 病斑上子实体(分生孢子梗和分生孢子)多发生在病斑的边缘,新侵染的病斑更为明显,可见黑色的 霉层(分生孢子)。在病斑上并不总产生分生孢子,这主要取决于湿度条件。 7.2 保湿培养后病原菌特征 马铃薯银屑病菌产生透明的菌丝,菌丝分隔并分枝;分生孢子无分枝,具分隔。分生孢子轮生在分 生孢子梗末梢,状似“圣诞树”(参见图B.3)。分生孢子梗直立,两壁平行生长。分生孢子宽(7μm~ 8μm、长18μm~64μm。分生孢子最多8个分隔、暗褐色、基部圆、尾端细(参见图B.4)。 2GB/T28093—2011 7.3 PDA培养病原菌特征 分离物在PDA培养基上形成暗褐色至黑色菌落,浅棕色的分生孢子群分布在培养基表面。菌丝 在PDA上的生长速度为1.15mm/d~1.78mm/d。20℃下光照培养比黑暗培养的生长速度快。分生 孢子梗随培养时间的增加,颜色从浅灰色变为褐色,无分枝,1根~6根丛状生长,基部球形,7个~19个 隔膜,(150μm~550μm)×(7.0μm~10.0μm)。分生孢子近无色至褐色,单个或成簇地自分生孢子 梗基端往上呈轮状排列,直或稍弯,顶端渐尖,略呈锥形,3个~8个隔膜,(20μm~80μm)×(7.5μm~ 10μm),与自然薯块上产生的分生孢子大小基本相同。 8 结果判断 马铃薯块茎症状符合7.1,且经保湿培养和PDA培养后,符合7.2、7.3的鉴定特征可以判断为马 铃薯银屑病菌。 9 样品、菌种保藏 分离并鉴定为马铃薯银屑病菌的菌株要转移到斜面培养基上,于4℃冰箱中保存至少6个月。带 有马铃薯银屑病菌的块茎也于4℃冰箱中保存,其时间视薯块的情况,尽量保存。以备复检、谈判和仲 裁,保存期满后进行灭活处理。 3GB/T28093—2011 附 录 A (规范性附录) PDA培养基的制作方法 PDA培养基的制作(或选用市售PDA):马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g。马铃薯切块煮沸 10min,纱布过滤,加入葡萄糖,琼脂,加水定容至1000mL,121℃,高压灭菌20min,分装备用。 4GB/T28093—2011 附 录 B (资料性附录) 马铃薯银屑病菌症状及形态特征 图B.1 马铃薯银屑病菌在马铃薯块茎上的症状 图B.2 马铃薯银屑病菌在块茎上发展以后形成的圆形、从褐色到暗灰色的病斑,最后发展为银灰色 5GB/T28093—2011 图B.3 马铃薯银屑病菌保湿培养的微型“圣诞树”一样的分生孢子梗及分生孢子 图B.4 马铃薯银屑病的分生孢子 6GB/T28093—2011