ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28092—2011 落 叶松枯梢病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofBotryosphaerialaricina(K.Sawada)Y.Z.Shong 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人:吴翠萍、李彬、粟寒、高渊、陆军、吴晶、刘伟、高振兴、安榆林。 ⅠGB/T28092—2011 落叶松枯梢病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了落叶松枯梢病菌Botryosphaerialaricina(K.Sawada)Y.Z.Shong1987的检测和 鉴定方法。 本标准适用于对落叶松苗木、接穗以及带小枝梢的原木等样品携带落叶松枯梢病菌的检测和鉴定。 2 落叶松枯梢病菌基本信息 中文名:落叶松枯梢病菌。 学名:Botryosphaerialaricina(K.Sawada)Y.Z.Shong1987。 异名:PhysalosporalaricinaK.Sawada,Guignardialaricina(K.Sawada)W.Yamamoto& K.Ito。 病害英文名:shootblightoflarch,twigdiebackoflarch。 采用Ainsworth(1973)真菌分类系统,病原菌为子囊菌亚门Ascomycotina,腔菌纲Loculoascomy- cetes,格孢腔菌目Pleosporales,葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae,葡萄座腔菌属Botryosphaeria。 无性阶段为半知菌亚门Deuteromycotina,腔孢纲Coelomycetes,球壳孢目Sphaeropsidales,球壳孢 科Sphaeropsidaceae,大茎点霉属Macrophoma。 落叶松枯梢病菌的其他信息参见附录A。 3 方法原理 根据病原菌危害的症状特点(参见附录B)采集样品进行检测,观察病原菌产生的子实体的显微形 态特征,并结合病原菌的地理分布和寄主范围等有关信息进行结果判断。 4 仪器和用具 4.1 仪器 体视显微镜、普通光学显微镜(具显微拍摄和测量功能)、光照培养箱、高压灭菌器、干热灭菌器、冰 箱等。 4.2 用具 手持放大镜、试剂瓶、纱布、脱脂棉、镊子、剪刀、培养皿、修枝剪、吸管、酒精灯、打孔器(直径5mm)、 瓷盘、解剖刀、酒精灯、解剖针、载玻片、盖玻片、微量移液器、标本盒、海绵、胶带、标签等。 5 试剂 石蜡,70%、95%酒精,二氧化硅干燥剂。 1GB/T28092—2011 6 检测 6.1 样品采集 根据下列症状等进行样品采集:苗木、接穗上的新梢枯死,并且枯死的梢端呈弯曲状;在病组织上有 固着的白色滴状物树脂块;干枯的枝干部为紫褐色或灰褐色;在枯死的枝干、松针上有突出的枯梢病原 菌子实体。原木上如果带有的小枝梢,则应仔细观察小枝梢上有无子实体,若无,则可排除怀疑带有枯 梢病原菌。 6.2 样品制备 6.2.1 子实体的制片 用解剖针挑取样品上的子实体少许,置于载玻片上加盖玻片压碎或由发病部位直接切片制成水玻 片,在解剖镜或显微镜下观察子实体的形态并确认是否成熟。如果成熟,则观察典型形态特征并测量大 小;如果不成熟则需进一步培养。 6.2.2 不成熟子实体的培养 对子实体不成熟的部位,先用无菌水浸泡2d~3d,然后浸泡在35℃和10℃的无菌水中进行交替 变温处理,每次5min,重复1次,再浸在无菌水中30min,最后取出置室温条件下保湿培养中7d~12d, 诱导产生成熟子实体并制片镜检。 7 鉴定 7.1 有性阶段子实体形态特征 子囊座为壳状、瓶状或梨形,黑褐色,单生、2个~5个群生或丛生在病枝表皮下,成熟后仅孔口外 露,大小为(170μm~500μm)×(130μm~300μm)。子囊棍棒状,双壁,无色,顶端圆,下有短柄,平行 排列于子囊腔基部,大小为(115μm~149μm)×(20μm~45μm)。假侧丝很多,线形,无色,半永久存 在,直径3μm。子囊孢子8个,双行排列,椭圆形至纺锤形,单胞,无色,大小为(22.5μm~40μm)× (6.3μm~15.5μm)。参见附录C。 7.2 无性阶段子实体形态特征 分生孢子器群生于顶梢残留的叶背和顶梢小枝周围的表皮下,并使表皮突起,近球形或扁球形,黑 色,大小为(120μm~249μm)×(148μm~213μm)。分生孢子梗短,不分枝,圆柱形,(5μm~7μm) ×(2.5μm~3.2μm)。分生孢子椭圆形至纺锤形,单胞,无色,大小为(24μm~30μm)×(6μm~9μm)。 常见1~2个油球。参见附录C。 性孢子器球形至扁球形,单个或几个丛生于病枝表皮下,大小为(115μm~214μm)×(109μm~ 190μm)。性孢子梗细长,无色,2个~3个分隔,大小为(12μm~16μm)×(3μm~5μm)。性孢子短 杆状或椭圆状,无色,大小为(3μm~6μm)×(1μm~2μm)参见附录C。 8 结果判定 如有性阶段、无性阶段的形态特征符合第7章鉴定特征的描述,即可判定为落叶松枯梢病菌。 2GB/T28092—2011 9 标本和样品保存 发现落叶松枯梢病菌的样品,需制作成标本在室温条件下进行干燥保存,或将样品置于-20℃冷 冻保存,保存至少6个月,以备复检、谈判和仲裁。保存期满后进行灭活处理。 3GB/T28092—2011 附 录 A (资料性附录) 落叶松枯梢病菌其他信息 A.1 地理分布 国外:日本、朝鲜、韩国、俄罗斯(远东)。 国内:黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、山东、陕西、甘肃、青海、宁夏。 A.2 寄主 落叶松属(Larixspp.):华北落叶松(L.principisrupprechtii)、长白落叶松(L.olgensisvar.chan- gpaiensis)、朝鲜落叶松(L.olgensisvar.koreana)、海林落叶松(L.olgensisvar.heilingensis)、日本落叶 松(L.leptolepis)、黄花落叶松(L.olgensis)、欧洲落叶松(L.decidua)、美国西部落叶松(L. occidentalis)、美加落叶松(L.laricina)等。 A.3 发病规律 该病从幼苗、幼树到成林的当年新梢都能发病,但幼树发病重。7月上旬开始发病显症状,7月中、 下旬发病最明显。一般都先从主梢发病,然后由树冠上部向下蔓延,加重病情。病后新梢渐渐褪色,顶 部弯曲下垂呈勾状,而顶梢与弯曲部分变紫褐色或灰褐色,从弯曲部分逐渐向下脱叶、干枯,茎收缩变 细,仅在顶部残留一簇叶子,枯萎呈紫灰色。次年春天,由侧芽生小枝代替原来主梢,连年发病、为害严 重的,树冠出现扫帚状丛枝,高度生长停止,形成小老树或全株枯死(为害症状参见附录B)。在枝梢受 害部位,多数有松脂溢出,凝成块状。8月末至翌年6月,在枯梢上特别是弯曲部分的枝皮及凹陷处,生 长着梭形小黑点,初埋生,至翌年6月突破寄主,形成病原菌子囊座。发病10余天后,在顶梢残留叶上 或弯曲部位可见圆形的散生小黑点,形成病原菌的分子孢子器。有时在病枝上可见圆形黑色突起,即性 孢子器。 4GB/T28092—2011 附 录 B (资料性附录) 落叶松枯梢病症状 图B.1 8年生日本落叶松枯梢病症状(图片来源T.Kobayashi,Japan) 5GB/T28092—2011 附 录 C (资料性附录) 落叶松枯梢病原形态特征 A———子囊; B———侧丝; C———子囊孢子; D———分生孢子器; E———分生孢子。 注1:图片仿KazuoIto 注2:图片比例尺为10μm 图C.1 落叶松枯梢病的病原特征 6GB/T28092—2011