ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28084—2011 棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定 DetectionandidentificationofVerticilliumdahliaeKleb. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前　　言 　　本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:全国农业技术推广服务中心、河南省植保植检站、四川省植物检疫站。 本标准主要起草人:吴立峰、韩世平、宁红、白小东、刘辉志、李素芳、熊红利、张磊。 ⅠGB/T28084—2011 棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定 1　范围 本标准规定了棉花黄萎病田间症状识别、抽样,棉花黄萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb.)的分离 培养、检测鉴定等方法。 本标准适用于棉花植物组织和棉籽中棉花黄萎病菌的检疫检测和鉴定。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB15569　农业植物调运检疫规程 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 微菌核　microsclerotium 棉花黄萎病菌生长过程中,由一条或数条分隔菌丝体膨大、胞壁增厚,并向各个方向芽殖形成的肉 眼可见的黑色菌丝颗粒。 3.2 选择性培养基　selectivemedium 进行植物病原菌分离培养时,为促进目标菌落的形成,抑制其他非目标菌的生长,在培养基中添加 不同的碳源、氮源或抑制性物质而形成的具有一定选择能力的培养基。 4　原理 棉花黄萎病菌主要存在于棉花植株、棉籽、土壤、病残组织、粪肥等处,侵染棉花植株后所表现的典 型症状是田间诊断的重要依据;利用选择性培养基,从不同的带菌材料中分离出目标病原菌,进行形态 特征鉴定。 5　仪器、用具及试剂 5.1　仪器、用具 天平、高压灭菌锅、培养箱、生物显微镜、移液器、镊子、解剖刀、接种棒、9cm~12cm培养皿、烧杯、 载玻片、盖玻片、吸管、超净工作台等。 5.2　试剂 除非另有说明,本标准仅使用分析纯试剂。 1GB/T28084—2011 5.2.1　磷酸氢二钾(K2HPO4)。 5.2.2　氯化钾(KCl)。 5.2.3　硫酸镁(MgSO4)。 5.2.4　L-天门冬酰胺(C4H8N2O3H2O)。 5.2.5　乙二胺四乙酸铁钠{[CH2N(CH2COO)2]2FeNa}。 5.2.6　L-山梨糖(C6H12O6)。 5.2.7　琼脂。 5.2.8　75%五氯硝基苯(C6Cl5NO2)。 5.2.9　牛胆盐。 5.2.10　四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)。 5.2.11　硫酸链霉素(C21H41N7O16S)。 5.2.12　葡萄糖(C6H12O6·H2O)。 5.2.13　0.1%升汞。 5.2.14　70%乙醇。 5.2.15　马铃薯。 5.2.16　灭菌水。 6　症状识别 在棉花黄萎病显症明显的花铃期和吐絮期进行2次~3次调查。每次调查时,首先目视全田,若观 察不到可疑病株,则进行踏查,方法是每隔两行顺垄检查有无可疑病株。对检查到的可疑病株,参照附 录A进行识别判断,确认是否是棉花黄萎病,并采集、保存病株标本,记录调查结果。现场不能确认的, 整株取样带回实验室鉴定,填写附录B《有害生物调查抽样记录表》。 7　病原鉴定 7.1　抽样 7.1.1　棉籽抽样 需要进行室内棉花黄萎病菌检测的棉籽,按照GB15569的有关要求进行抽样,填写附录B《有害生 物调查抽样记录表》,送实验室检验鉴定。 7.1.2　受害植株抽样 在棉花生长期间,特别是棉花黄萎病发病高峰期,加强田间观察,发现有棉花黄萎病疑似症状的植 株,整株取样送实验室检测。填写附录B《有害生物调查抽样记录表》。 7.2　分离和培养 7.2.1　制样 7.2.1.1　棉籽 将送检的每个棉籽样品分为2份,一份保存备查,一份用于检验,每份样品不少于50g。 7.2.1.2　植物组织 选取有疑似症状的植株材料:叶片材料取病健交界处组织,每个约0.5cm2;茎杆、叶柄材料直接切 2GB/T28084—2011 取维管束变色部分组织,每个长约0.5cm。 7.2.2　消毒与培养 7.2.2.1　棉籽 将棉籽放入70%乙醇中浸泡2s~3s,除去气泡,置于0.1%升汞液中消毒2min,用灭菌水冲洗 2次~3次。然后用灭菌镊子将其移放到Christen选择性培养基平板上,每个平板放置5粒,每个样品 设3个重复,置于24℃~25℃的培养箱内3d~4d,然后放入冰箱冷处理(0℃~5℃,24h),再放回原 培养箱内黑暗培养10d。 Christen选择性培养基配方及制作方法参见附录C。 7.2.2.2　植物组织 将取得的植物组织置于0.1%升汞液中表面消毒1min,用灭菌水冲洗2次~3次,然后置于Chris- ten选择性培养基平板上,每个平板放置3个~5个,每个样品设3个重复。置于24℃~25℃培养箱内 黑暗培养10d。 7.2.3　分离纯化 检查培养10d后的平板,若出现乳白色菌落,将其转接至PDA培养基上,并在24℃~25℃黑暗培 养10d。 PDA培养基配方及制作方法参见附录C。 7.2.4　形态鉴定 观察微菌核的形成情况,并挑取PDA平板上的培养物进行显微镜检查,参照附录D描述的病原菌 形态特征进行鉴定。 7.3　结果判定 转接至PDA平板上的培养物培养10d后,在显微镜下观察其形态特征,符合附录D描述的形态特 征的,确定为棉花黄萎病菌VerticilliumdahliaeKleb.。鉴定结果填入《有害生物样本鉴定报告》(参见 附录E)。 8　标本及资料保存 检测鉴定完成后,样品和分离物需作为标本保存的,制成标本并妥善保存1年。其余用于检测的样 品应集中销毁,用具应进行灭活处理。检测鉴定过程及有关数据、表格要进行详细记录并归档保存。 3GB/T28084—2011 附　录　A (资料性附录) 棉花黄萎病菌的分类地位及危害症状 A.1　分类地位 棉花黄萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb.)属半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomy- cetes)、丛梗孢目(Moniliales)、丛梗孢科(Moniliaceae)、轮枝菌属(Verticillium)。 A.2　危害症状 A.2.1　幼苗期症状 一般在3片~5片真叶期显示症状,病株比正常植株略矮,叶片上出现斑驳,剖开维管束有淡褐色 病变。 A.2.2　成株期症状 棉花黄萎病大多在现蕾后开始发病,开花结铃期达到发病高峰。病株一般从下部开始发病,逐渐向 上发展,病叶边缘和叶脉之间叶肉部分出现淡黄色斑驳,形状不规则,逐渐扩大成明显的黄色斑驳,随后 斑驳变褐,发病严重时,除主脉及主脉附近仍为绿色外,其余部分均变为黄褐色,病叶呈掌状斑驳,俗称 “西瓜皮”;有时病斑变褐、焦枯、脱落,只残留叶脉,呈“鸡爪状”。夏季低温多雨或大水漫灌后,植株可出 现急性萎蔫症状,叶片先从上部开始突然萎蔫下垂,水烫状,叶色暗淡,严重时叶片脱落形成光杆。用解 剖刀横切或纵切病株茎杆和叶柄,可见维管束变褐。 4GB/T28084—2011 附　录　B (资料性附录) 有害生物调查抽样记录表 表B.1　有害生物调查抽样记录表 编号: 生产/经营者 地址及邮编 联系/负责人 联系电话 调查日期 抽样地点 样品 编号植物名称(中文名和学名) 品种名称 植物生育期调查代表 株数或面积植物来源 症状描述: 发生与防控情况及原因: 抽样方法、部位和抽样比例: 备注: 抽样单位(盖章): 填表人(签名): 年　　月　　日　生产/经营者: 现场负责人: 年　　月　　日 　　注:本单一式两份,分别由抽样单位和受检单位保存。 5GB/T28084—2011 附　录　C (资料性附录) 培养基配方及制作方法 C.1　Christen选择性培养基配方及制作方法 C.1.1　配方 磷酸氢二钾1g,氯化钾0.5g,硫酸镁0.5g,乙二胺四乙酸铁钠0.01g,L-天门冬酰胺2g,L-山梨糖 2g,琼脂20g,蒸馏水1000mL,75%五氯硝基苯1g,牛胆盐0.5g,四硼酸钠1g,硫酸链霉素0.3g。 C.1.2　制作方法 琼脂20g加入蒸馏水1000mL,加热溶化后,加入磷酸氢二钾1g,氯化钾0.5g,硫酸镁0.5g,乙二 胺四乙酸铁钠0.01g,L-天门冬酰胺2g,L-山梨糖2g,充分混和溶解。用磷酸将pH值调至5.4,分装, 120℃~125℃高压灭菌30min,温度降至50℃(不烫手)时,在灭菌条件下加入75%五氯硝基苯1g、牛 胆盐0.5g,四硼酸钠1g,硫酸链霉素0.3g,混和均匀。 C.2　PDA培养基配方及制作方法 C.2.1　配方 马铃薯200g,葡萄糖15g~20g,琼脂17g~20g,水1000mL。 C.2.2　制作方法 将洗净去皮的马铃薯切碎,加水1000mL煮沸1h,用纱布滤去马铃薯,加水补足1000mL;加入葡 萄糖和琼脂,加热使琼脂完全熔化后,分装,120℃~125℃高压灭菌30min。 6GB/T28084—2011