ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28081—2011 烟草环斑病毒检疫鉴定方法 Detectionandidentificationoftobaccoringspotvirus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前　　言 　　本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫 局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:陈青、林石明、杨翠云、张毅、陈红运、廖富荣、郑云、李斌。 ⅠGB/T28081—2011 烟草环斑病毒检疫鉴定方法 1　范围 本标准规定了烟草环斑病毒检疫鉴定的基本原则和方法。 本标准适用于可能携带烟草环斑病毒的种子、苗木、鳞球茎、组培苗等繁殖材料及其产品的检疫 鉴定。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T1146　植物检疫　烟草环斑病毒检疫鉴定方法。 3　烟草环斑病毒基本信息 中文名:烟草环斑病毒。 学名:tobaccoringspotvirus。 缩写:TRSV。 属豇豆花叶病毒科Comoviridae,线虫传多面体病毒属Nepovirus病毒。 TRSV的传播途径多样,可以通过种子、嫁接、机械接种和介体传播。 烟草环斑病毒其他信息参见附录A。 4　方法原理 利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、体外反转录和体外DNA合 成技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行检测鉴定。 5　仪器设备、用具及试剂 5.1　仪器设备 洗板机、酶联检测仪、高速冷冻离心机、电子天平(感量0.001g)、超净工作台、旋涡混合仪、PCR 仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、榨汁机、水浴锅。 5.2　用具 微量移液器(0.5μL,2μL,10μL,20μL,100μL,200μL,1000μL)、化学PCR反应管和(或)96孔 光化学PCR反应板、酶联板、研钵。 5.3　试剂 双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂(见B.1)。 1GB/T28081—2011 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测试剂(见C.1)。 实时荧光RT-PCR检测试剂(见D.1)。 IC-RT-PCR检测试剂(见E.1)。 6　种苗的检测鉴定 6.1　种子检测鉴定 挑取500粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中,待长出3片~4片叶后将表现症状 的植株编号,未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号。采集的叶片分成两份,分别用于酶联测定 和分子生物学检测。 也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。 6.2　苗木、组培苗检测鉴定 有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测,分组方法和检测方法同6.1。 6.3　鳞球茎检测鉴定 取鳞球茎的小芽或鳞片进行酶联测定和分子生物学检测。 6.4　植物产品的检测鉴定 植物产品有症状的部分单独检测。没有症状或无法的观察症状的植物产品,应按比例取样,检测方 法为酶联测定和分子生物学检测。 7　检测 7.1　双抗体夹心酶联免疫吸附测定 把制备的样品上清液加入已包被TRSV抗体的96孔酶联板中,进行DAS-ELISA检测,每个样品 平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照,感染TRSV的植物组织作阳性对照,样品提取缓冲 液作空白对照,其中阴性对照种类和材料(如:种子或叶片)应尽量与检测样品相一致。 具体操作见附录B。 7.2　RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后,进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对 照,感染TRSV的植物组织作阳性对照,超纯水作空白对照。 具体操作见附录C。 7.3　实时荧光PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后,进行实时荧光PCR检测。健康的植物组织 作阴性对照,感染TRSV的植物组织作阳性对照,超纯水作空白对照。 具体操作见附录D。 7.4　IC-RT-PCR检测 把制备的样品上清液加入已包被TRSV抗体的离心管中,然后进行IC-RT-PCR扩增。健康的植 2GB/T28081—2011 物组织作阴性对照,感染TRSV的植物组织作阳性对照,超纯水作空白对照。 具体操作见附录E。 8　结果判定 7.1、7.2、7.3、7.4中如果两种方法的检测结果为阳性,即可判断该批种苗携带烟草环斑病毒。一 般是酶联测定为阳性后,分子生物学检测为阳性即可判断为携带有烟草环斑病毒。必要时可进行生物 接种试验,具体操作按照SN/T1146规定的方法执行。 9　样品保存、结果记录与资料保存 9.1　样品保存 经检验确定携带烟草环斑病毒的样品应在合适的条件下保存,种子保存在4℃,病株在-20℃或 者-80℃冰箱中保存,做好标记和登记工作。 9.2　结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等,并要有经手人和检测人员 的签字。酶联测定应有酶联板反应原始数据,RT-PCR检测应有扩增结果图片,生物学接种应有症状 照片。 3GB/T28081—2011 附　录　A (资料性附录) 烟草环斑病毒简介 A.1　寄主范围 TRSV自然寄主范围非常广泛,可侵染54科300多种植物,主要的经济作物有:大豆(Glycine max)、马铃薯(Solanumtuberosum)、甘薯(Ipomoeabatatas)、烟草(Nicotianatabacum)、西瓜 (Citrulluslanatus)、黄瓜(Cucumissativus)、甜瓜(cucumismelo)、胡萝卜(Daucuscarota)、唐菖蒲 (Gladiouscummunis)、李属(PrunusL.)、葡萄(Vitisvinifera)等。 A.2　病害症状 因寄主不同可产生不同的症状,一般在生长季节初始,幼嫩植株上的症状较严重,而在生长季节后 期不太明显。TRSV造成叶片系统褪绿斑、坏死环斑,茎顶枯,根腐烂,危害严重时导致植株矮化,结果 少和果实变小畸形。有的症状在后期可恢复,表现为无症带毒。 大豆:顶芽卷曲(芽枯萎),其他芽逐渐变褐色且易碎。在茎干和多数叶片的叶柄上产生褐色条纹, 豆荚不发达且结实。在结荚后感染则可能产生黑色污点。 烟草:在叶片上产生环形及线状斑,植株矮化。 葫芦:植株矮化、叶片斑驳、果实畸形。 葡萄:新长出的枝条柔弱、稀疏,节间变短。叶小且扭曲,植株矮小、产果少且变形。 A.3　分布地区 TRSV在日本、韩国、印度、中国台湾地区、美国、土耳其、加拿大、墨西哥、阿根廷、巴西、澳大利亚、 新西兰等50多个国家和地区均有分布。 A.4　传播途径 TRSV在大豆上的种传率有时可达到100%。主要的传播介体为美洲剑线虫Xiphinemaameri- canum。此外在实验室条件下确定能传播TRSV的昆虫介体有许多,如烟蓟马Thripstabaci和烟草跳 甲Epitrixhirtipennis等。 A.5　血清学特性 TRSV免疫原性强。 A.6　粒体形态 病毒粒体为等轴二十面体球状颗粒,直径约28nm。 4GB/T28081—2011 A.7　基因组 病毒基因组含两条ssRNA。RNA-1长7514nt,RNA-2长3929nt,外壳蛋白基因1548nt。 5GB/T28081—2011 附　录　B (规范性附录) 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 B.1　试剂 B.1.1　包被抗体 特异性的烟草环病毒抗体。 B.1.2　酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的烟草环斑病毒抗体。 B.1.3　底物 对硝基苯磷酸二钠(pNPP) B.1.4　样品抽提缓冲液(pH7.4) 　　PBST　　　　　　　　　　　　　1L Na2SO3 1.3g PVP(MW24000~40000) 20g NaN3 0.2g 用NaOH或HCl调节pH值到7.4。4℃储存。 B.1.5　包被缓冲液(pH9.6) Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.93g NaN3 0.2g 加入900mL蒸馏水溶解,用HCl调节pH值到9.6,蒸馏定容至1L。4℃储存。 B.1.6　PBST缓冲液(洗涤缓冲液pH7.4) NaCl 8.0g Na2HPO4 1.15g KH2PO4 0.2g KCl 0.2g Tween-20 0.5mL 加入900mL蒸馏水溶解,用NaOH或HCl调节pH值到7.4,蒸馏水定容至1L。 每升PBS中加入0.5mL的Tween-20。 B.1.7　酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4) PBST 1L BSA(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉2.0g 6GB/T28081—2011