ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28078—2011 水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌 检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofXanthomonasoryzaepv.oryzae(Ishiyama) Swingsetal.、Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Fangetal.)Swingsetal. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前　　言 　　本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国湖南出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国厦门出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:朱金国、赵文军、唐连飞、朱水芳、莫瑾、彭梓、陈红运、钟文英。 ⅠGB/T28078—2011 水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌 检疫鉴定方法 1　范围 本标准规定了水稻种子和其他水稻材料的水稻白叶枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo) 和水稻细菌性条斑病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Xcola)的检疫鉴定以植物的形态学特征、生 理生化特性、分子生物学和酶联免疫学技术作为依据,明确了田间观察、分离鉴定、样品保存的方法。 本标准适用于水稻材料和相关环境中水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌的检测。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB15569—1995　农业植物调运检疫规程 ISTA　国际种子检验规程 3　方法原理 根据水稻植株的形态学特征进行田间观察,并采用分离培养、分子生物学和酶联免疫学筛选、生理 生化鉴定以及致病性测定对植株材料上的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌进行判定。 4　设备和材料 4.1　冷冻高速离心机:转速≤15000r/min。 4.2　PCR扩增仪。 4.3　恒温培养箱:28℃±1℃。 4.4　显微镜:物镜头10×~100×。 4.5　天平:精度0.001g。 4.6　高压灭菌器。 4.7　均质器:转速4000r/min~8000r/min。 4.8　可调移液器:0.2μL~1μL,1μL~10μL,10μL~100μL,100μL~1000μL。 4.9　器具:灭菌的镊子、剪刀、称量勺。 4.10　吸管:1mL、10mL。 4.11　灭菌平皿:直径90mm,玻璃或一次性塑料平皿。 4.12　三角瓶:100mL。 5　培养基和试剂 5.1　SPA培养基:见A.1。 1GB/T28078—2011 5.2　0.001%吐温20-磷酸盐缓冲液。 5.3　革兰氏染色试剂:见A.2。 5.4　鞭毛染色试剂:见A.3。 5.5　明胶液化培养基:见A.4。 5.6　氧化酶试剂:见A.5。 5.7　硝酸盐培养基:见A.6。 5.8　过氧化氢酶试验试剂:见A.7。 5.9　石蕊牛乳试剂:见A.8。 5.10　糖氧化和发酵测定培养基:见A.9。 5.11　碳源利用试验培养基:见A.10。 5.12　水杨苷产酸试验培养基:见A.11。 5.13　2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)。 6　田间检验 水稻在整个生育期的叶片均可受害,在苗期、分蘖期受害最重,通过田间观察可直接对水稻受害情 况进行判断,水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌田间症状及相关资料参见附录B和附录C。对田 间检验有病害发生的植株,按以下操作进行抽样及实验室检验。 7　抽样 水稻种子抽样可参照ISTA《国际种子检验规程》或者GB15569—19956.1方法进行。 8　样品处理 8.1　水稻种子 大量种子样品通常需先用蒸馏水冲洗以除去残片和表面的污染杂菌,以避免杂菌太多产生干扰。 清洗后称取10g或400粒种子,放入0.001%吐温-磷酸缓冲液中低温(5℃~15℃)浸泡4h~6h,用 均质器打碎,制备样品提取液。如果是检测少量的种子样品,取20粒种子加入10mL灭菌的磷酸缓冲 液,用灭菌槌和研钵或是搅拌器将种子完全压碎制成提取液。 将样品提取液于22℃~25℃环境中放置4h~6h。旋涡混匀悬浮液5min,制备10×、100×和 1000×三个稀释度的悬浮液,从原液及每个梯度稀释液中取0.3mL,分别放入到3个SPA的平皿中 (每个平皿加入0.1mL)。用L-型玻璃棒将液体均匀涂布在SPA琼脂的表面。 若提取液杂菌较多,可考虑增加稀释梯度和接种平板的数量以提高检出率。 8.2　植物组织材料 8.2.1　无症状的组织 可将10g左右样品直接放入90mL0.001%吐温-磷酸盐缓冲液中,均质1min制备成样品提取 液。按8.1方法进行稀释与涂布。 8.2.2　未显症的可疑组织 用灭菌的剪刀剪成小块,将其置入SPA分离平板中,滴入2滴~3滴(约0.2mL)的生理盐水,放 2GB/T28078—2011 置5min~10min,让细菌从这些组织中渗出,用灭菌的接种环蘸取渗出液,在SPA培养基上进行分离 培养。 8.2.3　受感染组织 从叶片损伤部位的前端切下2mm×7mm片段。将其放入70%的乙醇消毒中15s~30s,然后在 试管中用灭菌蒸馏水清洗叶片2次~3次,最后将其置于SPA分离平板上。如植物组织材料上出现菌 脓或菌痂,直接用接种工具取菌脓或菌痂于SPA分离平板上涂布。 9　分离 接种后每天观察SPA平板的菌株生长状况。水稻白叶枯病菌(Xoo)生长速度较慢,一般要在 72h~96h才形成可见菌落。菌落呈圆形、光滑、表面凸起、粘稠,由黄白色逐渐变成淡黄色,在发射光 下不透明。菌落在第3天或第4天时只有小圆点般大小,在第5天至第7天时直径有1mm~2mm。 水稻细菌性条斑病菌(Xcola)菌株则在48h~72h后出现,生长速度比Xoo快,菌落圆形、光滑、凸起、 粘质,先为白色成熟后变浅黄色。菌落在第3天直径达到1mm。 培养24h后开始观察菌落生长情况,标记并排除48h之内平板中出现的亮黄色菌落。选择浅黄 色且黏液样的单个菌落接种于SPA培养基中,每个平皿挑取5个以上典型或疑似菌落进一步培养纯 化,以进行进一步生化鉴定试验。对疑似菌落也可以采用PCR方法进行初筛,或者采用水稻白叶枯病 菌和水稻细菌性条斑病菌的ELISA试剂盒进行初步筛选(具体检测方法参照试剂盒说明手册),阳性结 果再继续通过生化鉴定做进一步证实。 10　PCR筛选试验 从分离培养的细菌菌株中提取DNA作为模板,进行PCR检测和电泳分析。用水稻白叶枯标准菌 株或水稻细菌性条斑标准菌株基因组DNA作为阳性对照,用不含有水稻白叶枯菌株或水稻细菌性条 斑菌株的植物组织材料或其他植物病原菌基因组DNA为阴性对照,用双蒸水作空白对照,进行PCR 扩增,将扩增产物进行琼脂糖电泳分析。 将分离得到的可疑菌落接种SPA斜面,培养48h~72h后用无菌水洗下斜面上生长的菌苔,制成 菌悬液。使用制备好的菌悬液按照附录D进行分子生物学鉴定。若测试菌株的PCR产物与阳性对照 相对分子质量一致,继续进行生化鉴定试验。 11　生化鉴定 11.1　初步鉴定 挑取分离培养得到的符合特征的可疑菌落分别进行氧化酶试验,过氧化氢酶试验、革兰氏染色和鞭 毛染色观察,黄单胞菌属菌为氧化酶阴性或延迟反应(15s~16s),过氧化氢酶阳性,革兰氏染色阴性, 单生极鞭杆菌。符合以上试验结果的菌落则初步鉴定为疑似黄单胞菌属(Xanthomonas)。 11.2　硝酸盐还原试验 于28℃培养后的菌悬液中加入硝酸盐还原试剂,观察颜色反应,黄单胞菌不利用硝酸盐,为不变色 的阴性反应。 3GB/T28078—2011 11.3　明胶液化 挑取纯化后菌落穿刺接种营养明胶琼脂后,28℃±1℃培养7d~14d。每天观察结果,不加摇动, 静置冰箱中待其凝固后,再观察其是否被液化,如确被液化,即为试验阳性。 11.4　石蕊牛乳反应 将纯化后菌接种于石蕊牛乳培养基中,置28℃±1℃孵育3d、7d和14d,定时观察结果。水稻细 菌性条斑病细菌能够胨化牛乳中的酪蛋白,使培养基上层液体变澄清,而水稻白叶枯病菌没有胨化 作用。 11.5　葡萄糖氧化和发酵测定 挑取纯化后菌落刺接种到底部,厌氧培养的需加1cm厚的灭菌凡士林油(石蜡油与凡士林等量混 合)或3mL3%的琼脂封管。每种细菌接种4管,2管封管,2管不封,另设置2管不加菌进行对照。 28℃±1℃培养5d,观察结果。 葡萄糖氧化产酸只在开管的上部产酸,指示剂的颜色由橄榄绿色转黄;发酵产酸则在开管和闭管中 都可产生酸,如果同时还产生气体,则培养基内可以看到气泡。 好氧性细菌,只在开管的上部生长;兼性厌氧性细菌,则在开管的上下部都能生长;厌氧性细菌,则 只能在开管的下部和闭管中生长。 黄单胞菌为严格好氧性,属于氧化型(O)。 11.6　阿拉伯糖发酵 步骤同葡萄糖发酵步骤。阳性菌产酸,培养基变黄色,阴性细菌不利用阿拉伯糖,培养基不变色。 11.7　利用天冬酰胺为唯一碳源和氮源试验 挑取纯化培养后菌落接种天冬氨酸为唯一碳源和氮源的培养基,28℃±1℃培养3d、7d和14d 后,观察生长情况,有菌落生长者为阳性。 11.8　利用丙氨酸为唯一碳源试验 挑取纯化培养后菌落接种丙氨酸为唯一碳源和氮源的培养基,28℃±1℃培养3d、7d和14d后, 观察生长情况,有菌落生长者为阳性。