ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28073—2011 南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法 Detectionandidentificationofarabismosaicvirus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前　　言 　　本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:廖富荣、于翠、张永江、陈红运、林石明、陈青、黄蓬英、沈建国、吴媛。 ⅠGB/T28073—2011 南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法 1　范围 本标准规定了南芥菜花叶病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法。 本标准适用于植物种子、鳞球茎、苗木和组培苗等植物及其产品中南芥菜花叶病毒的检测与鉴定。 2　南芥菜花叶病毒基本信息 中文名:南芥菜花叶病毒。 英文名:arabismosaicvirus。 异名:arabismosaicnepovirus;hopnettleheadvirus(啤酒花荨麻病病毒);rhubarbmosaicvirus(大 黄花叶病毒);raspberryyellowdwarfvirus(悬钩子黄矮病毒);ashringandlinepatternviurs(白腊树 环线状病毒);rhabarber-mosaik-virus(大黄花叶病毒);forsythiayellownetvirus(连翘黄网状病毒); jasmineyellowblotchvirus(茉莉黄斑病毒)。 英文缩写:ArMV。 属豇豆花叶病毒科Comoviridae,线虫传多面体病毒属Nepovirus。 南芥菜花叶病毒的其他信息参见附录A。 3　方法原理 利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、反转录和体外DNA扩增技 术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行检测鉴定。 4　主要仪器设备 本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备: 微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平(感量:0.001g)、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳 槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计等和各种量程的可调移液器(1000μL、200μL、 100μL、20μL、10μL、2μL)。 5　检测与鉴定 5.1　DAS-ELISA检测 把0.5g~1.0g样品充分研磨或在液氮中研磨,按1∶10比例加入样品提取缓冲液,转移到5mL 离心管中,8000r/min离心5min,上清液作为DAS-ELISA的检测提取液。 设置阴性对照、阳性对照和空白对照,阴性对照的种类和材料(如:种子或叶片)应该尽量与所检测 样品类型相一致。具体操作过程见附录B。 注:提取液在3h内使用,否则保存在4℃中。 1GB/T28073—2011 5.2　RT-PCR检测 分别提取检测样品的总RNA,然后用RT-PCR检测。用健康的植物组织作阴性对照,用感染 ArMV的植物组织作阳性对照,用超纯水作空白对照。 具体操作过程见附录C。 5.3　实时荧光RT-PCR检测 分别提取检测样品的总RNA,反转录合成cDNA后用实时荧光PCR检测。用健康的植物组织作 阴性对照,用感染ArMV的植物组织作阳性对照,用超纯水作空白对照。 具体操作过程见附录D。 5.4　序列测定 将PCR产物回收后,进行克隆、测序,或者直接测序,测序可由生物公司完成。把测序所得到的核 苷酸序列与已知的ArMV相应序列进行比对,如果翻译后氨基酸序列与已知的ArMV相应序列同源 性大于75%则判定为ArMV序列,小于75%则判定为非ArMV序列。 注:序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行,网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 6　结果判定与报告 6.1　结果判定 当产生以下检测结果时,则判定为检出ArMV: ———当DAS-ELISA检测、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测,其中有两种方法检测结果呈阳 性时,判定为检出ArMV; ———当RT-PCR检测结果呈阳性,测定的序列为ArMV序列,则判定为检出ArMV。 6.2　结果记录与保存 记录各项实验数据,包括样品种类、来源,检测时间、地点、方法和结果等。血清学检测结果保存吸 光值的数据报告,RT-PCR检测结果保存电泳照片,实时荧光RT-PCR检测结果保存采集的数据,序列 测定结果保存测序报告图。 2GB/T28073—2011 附　录　A (资料性附录) 南芥菜花叶病毒简介 A.1　分布 欧洲:奥地利、白俄罗斯、比利时、保加利亚、塞浦路斯、捷克共和国、丹麦、芬兰、法国、德国、匈牙利、 爱尔兰、意大利、拉脱维亚、立陶宛、卢森堡公国、摩尔多瓦、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐 克、斯洛文尼亚、瑞典、瑞士、英国、乌克兰和南斯拉夫。 亚洲:日本、哈萨克斯坦、土耳其、伊朗。 非洲:南非。 北美洲:加拿大、美国。 大洋洲:澳大利亚、新西兰。 A.2　形态特征 该病毒属线虫传多面体病毒,病毒粒体为等轴对称二十面体,直径约30nm,为双分体病毒,含有 两条相对分子质量分别为2.4×106和1.4×106的单链RNA。超速离心后分为T(53S),M(93S)和 B(126S)三个组分。该病毒具有一个外壳蛋白,相对分子质量为54kDa。 A.3　寄主范围及症状 ArMV可侵染174属215种植物。主要为害的作物有大麻(Cannabissativa)、啤酒花(Humulus lupulus)、黄瓜(Cucumissativus)、西葫芦(Cucurbitapepo)、莴苣(Lactucasativa)、草莓(Fragaia ananassa)、葡萄(Vitisvinifera)、香石竹(Dianthuscaryophyllus)、水仙(Narcissustazetta)、蔷薇 (Rosamultiflora)、草木樨(Melilotussuaveolens)、郁金香(Tulipagesneriana)、芹菜(Apiumgraveo- lens)、薄荷(Menthasppiperita)、丁香(Syringaoblata)、大豆(Glycinemax)、甜菜(Betavulgaris)、马 铃薯(Solanumtuberosm)、烟草(Nicotianatabacum)、番茄(Lycopericonesculentum)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、豇豆(Vignaunguiculata)、蚕豆(Viciafaba)、豌豆(Pisumscatwum)、甜瓜(Cucumis melo)、花椰菜(BrassicaoleraceaL.var.botrytis)、菠菜(Spinaciaoleracea)、胡萝卜(Daucus carota)等。 ArMV引起的最常见症状是叶片斑驳和脱落、植株矮化、严重畸型、耳突。症状随着寄主植物、病 毒的分离物、栽培条件、季节和年份的不同而改变。有时候ArMV的侵染是隐症的,并不会在寄主植物 上表现症状。 在鉴别寄主上产生的症状: a)　昆诺藜(Chenopodiumquinoa)和苋色藜(C.amaranticolor)接种叶上形成褪绿的局部斑点,然 后形成系统性斑驳; b)　黄瓜(C.sativus):接种的子叶上产生褪绿的局部斑点,以及系统性脉带或黄色斑点; c)　菜豆(P.vulgaris):产生坏死的局部枯斑、系统性坏死和畸型; d)　矮牵牛(Petuniahybrida):产生局部坏死斑点或小的坏死环和系统性环斑,以及线状斑或 明脉。 3GB/T28073—2011 然而,并不是所有株系能够产生这些明显区别的症状,如啤酒花株系(ArMV-H)就不能产生这些 明显的症状。另外,ArMV经常与草莓潜隐环斑病毒(strawberrylatentringspotvirus,SLRV)等病毒 混合侵染,从而产生更加复杂的症状。因此,使用鉴别寄主进行鉴定时,还需结合其他方法,如DAS- ELISA等。 A.4　传播途径 ArMV主要通过汁液摩擦接种,种苗传播也很普遍,也可通过介体线虫传播。 通过种子传播的寄主:莴苣(L.sativa)、松草莓(F.ananassa)、大豆(G.max)、甜菜(B.vulgaris var.saccharifera)、番茄(L.esculentum)等。 通过块茎传播的寄主:马铃薯(S.tuberosm)等。 通过鳞球茎传播的寄主:水仙(N.tazetta)、郁金香(Tulipagesneriana)、百合(Liliumbrownii var.colchesteri)等。 通过苗木传播的寄主:葡萄(V.vinifera)、草莓(F.ananassa)、啤酒花(H.lupulus)、香石竹 (D.caryophyllus)、蔷薇(R.multiflora)等。 传播介体主要为异尾剑线虫(Xiphinemadiversicaudatum)。 A.5　血清学特性 ArMV具有很强的免疫原性,提纯的病毒免疫兔子后,可以制备出高质量的抗血清。ArMV抗血 清与烟草环斑病毒(tobaccoringspotvirus,TRSV)、番茄环斑病毒(tomatoringspotvirus,ToRSV)抗 血清之间无交叉反应,与健康寄主和常见的