ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28072—2011 梨 黑斑病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofAlternariagaisenK.Nagano 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国河北出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:严进、宋福、赵文胜、吴品珊、王朝华、陈克、黄英、陈岩、张秋娥。 ⅠGB/T28072—2011 梨黑斑病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准确立了梨黑斑病菌检疫检测和鉴定方法。 本标准适用于对来自梨黑斑病发生国家和地区的梨果实和梨属繁殖材料的检疫,以及国内疑似梨 黑斑病的果实、叶片和枝条的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 梨黑斑病菌基本信息 梨黑斑链格孢(AlternariagaisenK.Nagano)属真菌界Fungi,有丝分裂孢子真菌Mitosporic fungi。 梨黑斑病菌其他信息参见附录A。 4 方法原理 对梨黑斑病菌的鉴定可根据该真菌的寄主范围、传播途径、造成的植株症状(参见附录B)、病原形 态(参见附录C和附录D)以及是否对梨叶片致病等进行鉴定。 5 主要仪器设备 5.1 仪器设备 体视显微镜、生物显微镜(具油镜和测微尺)、普通天平(感量0.1g)、超净工作台、生物培养箱、高压 灭菌器。 5.2 试验用具 手持放大镜、培养皿、三角瓶(500mL)、试管(直径12mm)、烧杯(1000mL)、手术刀、手术剪、镊 子、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯。 6 检疫与鉴定 6.1 现场检疫 6.1.1 取样 按照SN/T2122规定的方法执行。 1GB/T28072—2011 田间取样方法:在果实生长期,仔细检查果园中果树,采集有典型梨黑斑病症状的果实、叶片和 嫩梢。 6.1.2 症状观察 6.1.2.1 果实症状 幼果发病初期,果面出现黑色小斑点,逐渐扩大呈圆形,病斑稍凹陷;成熟果实受害时,初期症状与 幼果相似,但发病快,病斑大,不规则,黑褐色。数个病斑可融合成大块病斑,果面变黑褐色。 6.1.2.2 叶片症状 嫩叶容易受害。叶片病斑初期为圆形或不规则形,后扩大呈同心环纹状,暗褐色,有时数个病斑融 合成不规则形大块病斑,并出现淡紫色环纹。湿度高时,病斑上产生黑色霉层。 6.1.2.3 新梢症状 产生黑色小斑点,发展成长椭圆形,暗褐色,凹陷,病健交接处产生裂缝。湿度高时,病斑表面有霉 状物。 6.2 实验室检测与鉴定 6.2.1 分离培养 采用马铃薯-胡萝卜培养基(PCA)(马铃薯20g、胡萝卜20g、琼脂15g、蒸馏水1000mL),用于病 原菌的分离、鉴定和菌种保存。 果实:在病斑周围的病健交界处用70%酒精擦洗消毒,用解剖刀去除表皮,取少许果肉腐烂部分放 在PCA培养基上,置于25℃培养箱中,12h光照,12h黑暗条件下培养3d~5d。 叶片和新梢:取病健交界部位边长约0.5cm组织,用0.5%NaClO表面消毒3min,用无菌水冲洗 3遍,置于PCA平板(直径9cm)培养基上,每皿放置3片~4片,于25℃培养箱内培养,黑暗和光照各 12h交替。3d~5d后用显微镜检查。 6.2.2 形态鉴定 6.2.2.1 产孢表型观察 将出现链格孢菌的培养皿置于实体显微镜下,在50×下观察,用极细解剖针(00号)挑取具有典型 A.gaisen产孢结构的单根孢子链上的孢子转接于PCA培养基平板上。将该培养基平板置于20℃~ 25℃的平台上,两支40W冷白光(4200k)灯管,8h照射和16h黑暗交替进行培养,灯管距离培养物约 40cm,培养物面向上,培养7d后将培养皿置于实体显微镜下(培养物面向上)观察产孢表型。 6.2.2.2 分生孢子形态测量 从菌落中挑取少量培养物,以水作浮载剂,制成玻片,在显微镜下观察。详细记录并测量分生孢子 大小,包括长、宽、喙长、横隔膜数、纵(斜)隔膜数,孢子颜色,孢子表面有无突起等。每个菌株测量30个 孢子。 6.2.3 致病性测定 将已初步鉴定的菌株进行叶片接种试验,取沙梨(Pyruspyrifolia)的嫩叶,每个菌株接种5片叶, 在叶片的正反两面用针刺造成伤口,将配好的孢子悬浮液(600000个孢子/mL)均匀涂在叶片的正反两 2GB/T28072—2011 面,以无菌水为对照。 将接种的叶片置于25℃±0.5℃的条件下培养5d,期间12h光照和12h黑暗交替,观察并记录发 病情况。 7 结果判定 7.1 产孢表型 分生孢子链直立,不分枝或基本不分枝,多数孢子链含5个~9个孢子。 7.2 分生孢子形态 分生孢子短卵形或长卵形,孢身(12.2μm~35.0μm)×(5.8μm~14.5μm),平均21.6μm× 10.3μm,喙呈短柱状或锥状,(2.0μm~8.7μm)×(2.3μm~4.6μm),平均4.1μm×3.7μm,孢子的 横隔膜数为1~4,纵斜隔膜数为0~3。 Alternariagaisen与近似种形态参见附录C和附录D。 7.3 致病性测定 叶片病斑初期为圆形或不规则形,后扩大成同心环纹状,暗褐色,有时数个病斑融合成不规则形大 块病斑,并出现淡紫色环纹。湿度高时,病斑上产生黑色霉层。 7.4 结论 如鉴定结果与7.1、7.2、7.3相符合,即可确定分离物为梨黑斑链格孢AlternariagaisenK. Nagano。 8 样品保存 将分离后纯化获得的梨黑斑链格孢Alternariagaisen菌种转入PCA斜面,置于常温条件下保存 至少12个月,以备复验、谈判和仲裁。 3GB/T28072—2011 附 录 A (资料性附录) 梨黑斑病菌Alternariagaisen分布和寄主 A.1 分布 欧洲:法国、意大利。 亚洲:中国(辽宁、吉林、青海、新疆、山东、河北、江苏、浙江、河南、广东、广西、山西、台湾)、日本、 韩国。 北美洲:美国(加里福尼亚、马里兰、密执安)。 A.2 寄主 梨黑斑链格孢的寄主只有梨属PyrusL.。 4GB/T28072—2011 附 录 B (资料性附录) 梨黑斑病症状 1———病果后期症状; 2———病果初期症状; 3———病叶及病部放大。 (图片来自华中农业大学植物科技学院《农业植物病理学》网络课件http://uhjy.hzau.edu.cn) 图B.1 梨黑斑病症状 图B.2 储藏期果实症状 5GB/T28072—2011 附 录 C (资料性附录) 表C.1 梨黑斑病菌Alternariagaisen与近似种区别 学名 产孢表型 分生孢子形态 对梨叶致病性 A.gaisen 分生孢子链直立, 不分枝或基本不分 枝,多数孢子链含 5个~9个孢子 孢身(12.2μm~35.0μm)×(9.8μm~18.5μm), 平均21.6μm×15.3μm 假喙呈短柱状或锥状,(2.0μm~8.7μm)× (2.3μm~4.6μm),平均4.1μm×3.7μm 横隔膜数为1~4,纵斜隔膜数为0~3对梨叶致病 A.alternata 分生孢子链分枝 繁复,致密 孢身(11.3μm~31.0μm)×(5.2μm~15.0μm), 平均21.5μm×10.3μm 假喙呈短柱状或锥状,(1.8μm~7.9μm)× (2.3μm~4.5μm),平均4.0μm×3.7μm 横隔膜数为1~4,纵斜隔膜数为0~3对梨叶不致病 A.tenuissima 分生孢子链长,每 链10个~15(~20) 个孢子,分枝很少 或无 分生孢子较长,倒棍棒形、卵形或长椭圆形,孢身 (23.2μm~47.1μm)×(6.6μm~14.7μm),平均 29.3μm×10.5μm 假喙(4.1μm~12.5μm)×(2.3μm~4.7μm),平 均6.7μm×3.6μm 横隔膜数为1~6,纵斜隔膜数为0~4。对梨叶不致病 A.infectoria 分生孢子链分枝 松散,次生孢子梗长 分生孢子倒棍棒形、卵形、长或短椭圆形,孢身 (14.4μm~51.0μm)×(5.6μm~16.3μm),平均 27.7μm×11.4μm 假喙(6.1μm~23.5μm)×(2.2μm~4.7μm),平 均10.2μm×3.5μm 横隔膜数为2~7,纵斜隔膜数为0~5对梨叶不致病 6GB/T28072—2011