ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28070—2011 黑麦草腥黑粉菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofTilletiawalkeriCastlebury&Carris 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前　　言 　　本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局,深圳市检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:章桂明、程颖慧、王颖、陆清、凌杏元、龙海、陈枝楠、刘新娇、仲建忠、杨伟东、 缪建锟。 ⅠGB/T28070—2011 黑麦草腥黑粉菌检疫鉴定方法 1　范围 本标准规定了黑麦草腥黑粉菌的检疫鉴定方法和检疫鉴定流程,明确了取样和样品保存方法。 本标准适用于黑麦草传带黑麦草腥黑粉菌的检测以及小麦中污染的黑麦草腥黑粉菌的检测。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18085　植物检疫　小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法 GB/T19495.2　转基因产品检测　实验室技术要求 SN/T2122　进出境植物及植物产品检疫抽样 3　黑麦草腥黑粉菌基本信息 中文名:黑麦草腥黑粉菌。 学名:TilletiawalkeriCastlebury&Carris(简称TW)。 英文名:ryegrassbunt。 属真菌界Fungi、担子菌门Basidiomycota、黑粉菌纲Ustomycetes、黑粉菌目Ustilaginales、腥黑粉 菌科Tilletiaceae、腥黑粉菌属Tilletia。 病粒及附着于健康种子表面的冬孢子是病原菌进行远距离传播的主要途径,由于该病局部侵染的 特性,在收获期间很难有效的清除混杂于健康种子中的病粒,因而病粒可随同小麦或黑麦草的资源性引 种或科研性引种而进行远距离传播。 黑麦草腥黑粉菌的其他信息参见附录A。 4　方法原理 根据黑麦草腥黑粉菌的生物学和形态学特征以及分子生物学特征,应用相关仪器,包括显微镜和 PCR仪等对小麦印度腥黑穗病菌进行鉴定。 5　检疫鉴定流程 检疫鉴定流程见图1。 1GB/T28070—2011 图1　黑麦草腥黑粉病菌检疫鉴定流程图 6　取样方法 散装船运黑麦草种子及小麦参照GB/T18085取样方法进行取样。 袋装黑麦草及小麦参照SN/T2122取样方法进行取样。 2GB/T28070—2011 7　主要仪器设备和试剂 7.1　主要仪器设备 7.1.1　摇床。 7.1.2　显微镜。 7.1.3　纯水器。 7.1.4　测序仪。 7.1.5　电泳仪。 7.1.6　低温冰箱。 7.1.7　显微操作仪。 7.1.8　超净工作台。 7.1.9　高压灭菌锅。 7.1.10　光照培养箱。 7.1.11　旋涡振荡器。 7.1.12　普通离心机。 7.1.13　冷冻干燥机。 7.1.14　凝胶成像仪。 7.1.15　核酸蛋白分析仪。 7.1.16　PCR仪(常规PCR仪、实时荧光PCR仪)。 7.1.17　破壁针(具有平截切面的针,能将孢子压碎)。 7.1.18　培养皿(9cm)。 7.1.19　筛网(40μm、20μm)。 7.1.20　孔径100μm的毛细管。 7.1.21　锥形瓶(250mL、500mL)。 7.1.22　盖玻片(18mm×18mm)。 7.1.23　PCR反应管(0.2mL,0.5mL)。 7.1.24　载玻片(25mm×76mm),厚(0.8mm~1.0mm)。 7.1.25　Tip头(0.1μL~10μL,5μL~200μL,100μL~1000μL)。 7.1.26　可调微量移液器(2μL,10μL,20μL,100μL,200μL,1000μL) 7.2　主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。 7.2.1　三氯甲烷。 7.2.2　异戊醇。 7.2.3　异丙醇。 7.2.4　醋酸钠。 7.2.5　甲酰胺。 7.2.6　70%乙醇。 7.2.7　无水乙醇。 7.2.8　Tris饱和酚。 7.2.9　Taq酶。 3GB/T28070—2011 7.2.10　Gelatin。 7.2.11　溴化乙锭。 7.2.12　DNAMarker。 7.2.13　PDA培养基。 7.2.14　SDS提取液。 7.2.15　PCR缓冲液。 7.2.16　电泳缓冲液。 7.2.17　上样缓冲液。 7.2.18　Bigdye试剂盒。 7.2.19　TaqManUniversalPCRMasterMix。 7.2.20　席尔氏浮载剂,见GB/T18085。 7.2.21　dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)。 8　检测与鉴定 8.1　实验室器皿和晒网前处理 将所有实验器皿和筛网浸泡于1.6%的次氯酸钠中15min,然后用蒸馏水冲洗5次。 8.2　形态学鉴定 对查找到菌瘿,或通过洗涤检验获得冬孢子的,先进行形态学鉴定。对菌瘿采用解剖针挑取菌瘿的 冬孢子,置于席尔氏液中制片,对洗涤检验采用滴管吸取冬孢子悬浮液制片,待冬孢子胶质鞘允分展开 后,进行封片,观察冬孢子的形状,孢壁结构,在100×油镜下测量冬孢子的大小,每个样品测量100个 冬孢子。 形态学鉴定的具体操作过程见附录B,TW与近似种的形态学图参见附录C。 8.3　单个冬孢子直接分子检测 对未查找到菌瘿,但通过洗涤检验发现疑似黑麦草腥黑粉菌冬孢子的,要进行单个孢子分子方法检 测。每个PCR反应检测1个冬孢子,共检测5个冬孢子。每次PCR检测应设立相应的阳性对照、阴性 对照和空白对照。 单个冬孢子直接分子鉴定的具体操作过程见附录D。 8.4　孢子培养物的分子检测 对未查找到菌瘿,但通过洗涤检验发现疑似黑麦草腥黑粉菌,而这些疑似黑麦草腥黑粉菌通过形态 学和单个孢子检测无法获得准确结果时,则要对孢子进行培养(培养方法见E.1),用培养物分子检测。 每次PCR检测须设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。 孢子培养物分子检测的具体操作过程见附录E、附录F。 8.5　序列测定与比对 将PCR产物纯化后,进行测序,或由生物公司完成。把测序所得的核苷酸序列与已知的黑麦草腥 黑粉菌相应序列进行比对。 序列比对的具体操作过程见附录G。 4GB/T28070—2011 9　结果判断与表述 9.1　形态学鉴定结果判断和表述 对查找到的菌瘿中的冬孢子或通过洗涤检验获取的冬孢子,所观察的症状和形态学特征与黑麦草 腥黑粉菌冬孢子的一致,且对其100个孢子大小测量平均值介于30μm~31μm,则判定该样品中含有 黑麦草腥黑粉菌;对其100个孢子大小测量平均值小于25μm或者大于35μm,则判定该样品不含有黑 麦草腥黑粉菌;如孢子大小介于25μm~30μm或31μm~35μm之间,则判定该样品含有疑似黑麦草 腥黑粉菌,须进行进一步分子检测。 9.2　单个孢子直接分子检测结果判断和表述 9.2.1　常规PCR检测结果判断和表述 单个孢子进行常规PCR检测,在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下,如样品的扩 增产生473bp的特异性条带,且测序比对与黑麦草腥黑粉菌一致的判定为该样品含有黑麦草腥黑粉 菌,如没有PCR扩增条带的则须挑取孢子进行萌发,进行分子检测。 9.2.2　实时荧光PCR检测结果判断和表述 对单个孢子进行MGB探针实时荧光PCR检测,在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的 情况下,则: ———检测Ct值小于或等于36,判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性; ———检测Ct值大于36,应重做实时荧光PCR,再次扩增后,如Ct值小于或等于36,判定同上;如再 次扩增后Ct值大于36,则需要挑取冬孢子进行萌发,用孢子培养物进行分子检测。 9.3　孢子培养物分子检测结果判断和表述 9.3.1　常规PCR判断和表述 对孢子培养物进行常规PCR检测,在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下,如样品 的扩增产生414bp(引物Tin11/Tin4)或473bp(引物P14)的特异性条带,则初步判定黑麦草腥黑穗菌 检测结果呈阳性,但需进一步进行实时荧光PCR检测或序列测定与比对进行结果验证,按照实时荧光 PCR检测或序列测定与比对结果进行最后结果判定;如该样品无特异性扩增条带,则判定黑麦草腥黑 穗菌检测结果呈阴性。 9.3.2　实时荧光PCR结果判定和表述 9.3.2.1　普通探针实时荧光PCR结果判定和表述 普通探针的实时荧光PCR检测,在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下,则: ———检测Ct值小于34,判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性; ———检测Ct值大于或等于34,判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阴性。 9.3.2.2　MGB探针实时荧光PCR结果判断和表述 MGB探针实时荧光PCR检测,在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下,则: ———检测Ct值小于或等于36,判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性; ———检测Ct值大于或等于40,判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阴性; 5GB/T28070—2011 ———检测Ct值在36~40之间,应重做实时荧光PCR,再次扩增后,如Ct值小于或等于36或者Ct 值大于或等于40,判定同上。 9.4　序列测定和比对 把测序所得